胡萌，韓瑩

（鐵道警察學(xué)院公安技術(shù)系，河南鄭州　450053；

威海市公安局刑偵支隊(duì)，山東威?！?64200）

19個(gè)常染色體STR復(fù)合擴(kuò)增體系在實(shí)際案件中的應(yīng)用探析

胡萌，韓瑩

（鐵道警察學(xué)院公安技術(shù)系，河南鄭州450053；

威海市公安局刑偵支隊(duì)，山東威海264200）

法醫(yī)DNA技術(shù)在案件的偵破與起訴過程中有著舉足輕重的作用。為進(jìn)一步適應(yīng)案件偵破需要、豐富我國DNA擴(kuò)增檢驗(yàn)試劑國產(chǎn)化的研究成果，公安部物證鑒定中心新研制了19個(gè)常染色體STR復(fù)合擴(kuò)增體系（以下簡稱“DNATyperTM19試劑盒”）。對19個(gè)常染色體STR復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行了試用，將其應(yīng)用于案件中口腔拭子、FTA卡、肋軟骨、精斑、煙頭、脫落細(xì)胞常規(guī)檢材，以探討該試體系在案件應(yīng)用中的實(shí)用性和有效性。

DNA；STR；復(fù)合擴(kuò)增；生物檢材；基因座

目前，法醫(yī)DNA技術(shù)在案件的偵破與起訴過程中有著舉足輕重的作用。為進(jìn)一步適應(yīng)案件偵破需要、豐富我國DNA擴(kuò)增檢驗(yàn)試劑國產(chǎn)化的研究成果，公安部物證鑒定中心新研制了19個(gè)常染色體STR復(fù)合擴(kuò)增體系（以下簡稱“DNATyperTM19試劑盒”）。本研究對該復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行了試用，將其應(yīng)用于案件中口腔拭子、FTA卡、肋軟骨、精斑、煙頭、脫落細(xì)胞常規(guī)檢材，以探討該試體系在案件應(yīng)用中的實(shí)用性和有效性。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)檢材

所有檢材均來自日常案件積累，口腔拭子10份、FTA卡10份、煙頭10份、肋軟骨5份、精斑5份、脫落細(xì)胞5份、牙齒10顆、股骨2份。

（1）儀器設(shè)備

AB公司9700型PCR熱循環(huán)儀，AB公司3500測序儀，AB公司AutoMate自動(dòng)提取儀。

（2）試劑

Chelex-100，AB公司Prefiler Express Forensic DNA Extraction Kit，DNATyperTM19擴(kuò)增試劑盒，IdentifilerTMplus擴(kuò)增試劑盒，DNATyperTM19檢測試劑盒。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.DNA提取

用Chelex-100提取法［1］提取口腔拭子、FTA卡、肋軟骨、煙頭、脫落細(xì)胞［2］、牙齒、骨骼［3］DNA。用兩步裂解法提取精斑中精子DNA，用AutoMate自動(dòng)提取儀對需要純化的DNA進(jìn)行純化。

2.DNATyperTM19擴(kuò)增

試劑盒DNA擴(kuò)增以及檢測擴(kuò)增體系采用10ul體系，其中緩沖液4μL，引物2μL，水3μL，模板1μL。PCR熱循環(huán)程序：95℃11分鐘；94℃30秒，59℃2分鐘，72℃1分鐘（28個(gè)循環(huán)）；60℃60分鐘；25℃保存。經(jīng)DNATyperTM19擴(kuò)增的樣品準(zhǔn)備：10μL內(nèi)標(biāo)+1000μL去離子甲酰胺，混合均勻；每管加入10μL上樣混合物+0.8μL擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻；Allelic Ladder加入0.5μL或1μL；95℃變性3分鐘，立即放在冰上冷卻3分鐘，之后盡快電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物用AB公司3500測序儀檢測，經(jīng)GeneMapperID X軟件分析。

3.IdentifilerTMplus擴(kuò)增試劑盒檢測

用IdentifilerTMplus擴(kuò)增試劑盒對上述檢材DNA進(jìn)行平行擴(kuò)增及檢測。其中擴(kuò)增采用10μL擴(kuò)增體系，模板量為1μL。PCR熱循環(huán)程序以及檢測上樣前樣品準(zhǔn)備均參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。擴(kuò)增產(chǎn)物用AB公司3500測序儀檢測，經(jīng)GeneMapperID X軟件分析。

二、結(jié)果

采用Chelex-100法、AutoMate自動(dòng)提取儀提取的口腔拭子、FTA卡、煙頭、肋軟骨、精斑、脫落細(xì)胞、骨骼、牙齒的分型結(jié)果見圖1～圖5。DNATyperTM19試劑盒與IdentifilerTMplus試劑盒對樣本DNA的分型結(jié)果一致，結(jié)果顯示圖譜清晰，STR位點(diǎn)完整，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pull up峰、Stutter帶、Split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)。

三、討論

圖1　FTA卡分型結(jié)果

圖2　精斑分型結(jié)果

圖3　煙頭分型結(jié)果

圖4　肋軟骨分型結(jié)果

圖5　脫落細(xì)胞分型結(jié)果

目前，IdentifilerTMplus擴(kuò)增試劑盒廣泛應(yīng)用于刑事案件中的生物物證的DNA檢測，但其16個(gè)STR基因座的選擇主要針對歐美等白種人群，有些基因座在中國人群中的檢測結(jié)果并不理想。

DNATyperTM19擴(kuò)增試劑盒采用五色熒光技術(shù)，分別為：FAM藍(lán)色、HEX綠色、TAMRA黃色、ROX紅色、分子量內(nèi)標(biāo)橙色?？梢酝瑫r(shí)對D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、D12S391、TPOX、TH01、PentaE和D6S1043 19個(gè)STR基因座進(jìn)行擴(kuò)增和檢測（基因座具體信息見表1），在IdentifilerTMplus擴(kuò)增試劑盒的基礎(chǔ)上，增加了在中國人群中遺傳多態(tài)性較高的PentaE、D6S1043［4］、D12S391［5］3個(gè)新基因座，提高了19個(gè)STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系在中國人群中的實(shí)用性擴(kuò)增效率。該體系中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均小于420bp，因此也是用于案件中常見的微量、降解檢材的檢測。

張慶霞等［6］對DNATyperTM19擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行了認(rèn)證檢測工作，從方法學(xué)、準(zhǔn)確性、均衡性、靈敏度、批次間穩(wěn)定性、耐受性、適應(yīng)性與一致性、種屬特異性、混合樣本等9個(gè)方面進(jìn)行了檢測。經(jīng)檢測，其檢驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，峰值均衡，對不同檢材有很好的適應(yīng)性，具有較高的檢測靈敏度及種屬特異性，并能夠?qū)旌蠘颖具M(jìn)行正確分型。

本研究進(jìn)一步對案件中常見的口腔拭子、煙頭、肋軟骨、精斑、脫落細(xì)胞、骨骼、牙齒等檢材從圖譜清晰度，STR位點(diǎn)完整性以及正確性，是否存在等位基因丟失、平衡擴(kuò)增以及Stutter峰等方面進(jìn)行分析評價(jià)，探討該試劑盒在實(shí)際常規(guī)案件中應(yīng)用的有效性和準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示DNATyperTM19試劑盒能夠有效擴(kuò)增檢測法醫(yī)實(shí)際案件中所涉及的各種常規(guī)生物檢材DNA。

表1　DNATyperTM19與IdentifilerTMplus基因座信息

［1］鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析［M］.北京：中國人民公安大學(xué)出版社，2002：37-40.

［2］Bright J A，Petricevic S F.Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles［J］.Forensic Sci Int，2004，145（1）：7-12.

［3］Davis G P，King J L，Budowle B，et al.Extraction platform evaluations：A comparison of Automate ExpressTM，EZ1 Advanced XL，and Maxwell 16 Bench-top DNA xtraction systems［J］.Legal Medicine，2012，14（1）：36-39.

［4］張斌.江蘇漢族人群Penta E、D6S1043基因座遺傳多態(tài)性調(diào)查［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2014（6）:584.

［5］鄭小婷，吳微微，郝宏蕾，等.浙江漢族人群D12S391和D6S1043基因座的遺傳多態(tài)性調(diào)查［J］.刑事技術(shù)，2009（6）:50-52.

［6］張慶霞，王順霞.DNATyperTM19熒光檢測試劑盒的法庭科學(xué)驗(yàn)證［C］//DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)應(yīng)用成果與展望Ⅳ，2015: 234-240.

責(zé)任編輯：賈永生

D919.4

A

1009-3192（2016）04-0024-03

2016-03-20

胡萌，女，河南鄭州人，鐵道警察學(xué)院公安技術(shù)系講師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)、分子生物學(xué)研究；韓瑩，女，山東威海人，威海市公安局刑偵支隊(duì)主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證研究。

本文為河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目“河南漢族Y染色體遺傳多態(tài)性調(diào)查與姓氏分析研究”（編號：162102310004）的階段性研究成果。