劉樣珍　凌梅燕　史寶軍（1.清遠海貝生物技術(shù)有限公司，清遠511853；2.廣東海大集團海大研究院，廣州511400）

6株光合細菌的分離及水質(zhì)凈化效果的研究

劉樣珍凌梅燕史寶軍
（1.清遠海貝生物技術(shù)有限公司，清遠511853；2.廣東海大集團海大研究院，廣州511400）

采用半固體試管法和厭氧培養(yǎng)法從對蝦養(yǎng)殖泥中富集篩選出6株光合細菌，分別編號為PSB-1、PSB-2、PSB-3、PSB-4、PSB-5、PSB-6，并對其降解水體氨氮、亞鹽、硫化物方面進行探討。結(jié)果表明，6株光合細菌對氨氮的最高降解率達到93.21%，對亞鹽的最高降解率達到99.84%，對硫化物最高降解率為50%。最終確定3株對3種有害物質(zhì)均有降解效果的光合細菌，為后續(xù)復(fù)合菌株提供實驗依據(jù)。

光合細菌；氨氮；亞鹽；硫化物

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，高密度養(yǎng)殖規(guī)模日益擴大，養(yǎng)殖水體常因池中殘餌、水生生物排泄物及尸體等的腐爛、分解，導(dǎo)致水質(zhì)惡化，使水體中營養(yǎng)元素N、P等發(fā)生非正常變化并產(chǎn)生氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒有害物質(zhì)，致使養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境嚴重惡化。非離子態(tài)的氨氮對養(yǎng)殖對象可以直接產(chǎn)生毒性，影響其生長和發(fā)育。在養(yǎng)殖旺季，由于氣溫高，導(dǎo)致異氧微生物大量繁殖，有機物被分解，釋放出大量的氨，硫化氫等有害物質(zhì)，從而影響魚蝦的生長、發(fā)育，引起魚蝦的疾病。光合細菌是一類以光為能源，能以自然界中有機物、硫化物等為營養(yǎng)，并能進行光作用的微生物，可將養(yǎng)殖池底由魚蝦排泄物、食物殘餌產(chǎn)生的氨氮等有毒物質(zhì)有效的降解。本實驗從對蝦池塘底泥篩選獲取6株光合細菌，并探討6株光合細菌水體中有害物質(zhì)的凈化作用，尋找能同時降解有害物質(zhì)并具有協(xié)同作用的菌株，為降解養(yǎng)殖水體中的有害物質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源

廣州市海鷗島對蝦養(yǎng)殖池塘

1.1.2儀器設(shè)備

顯微鏡（CX-31）、滅菌鍋、平板、pH計（pHS-3C）、紫外分光光度計（UV-1800）、低溫冷凍高速離心機等。

1.1.3培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：CH3COONa·3H2O 2g/L、CH3CH2COONa 2g/L、NaCl 1g/L、NH4Cl 0.5g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.2 g/L、FeSO410 mg/L、酵母膏1 g/L、CaCl20.0057g/2L、Na2CO30.0315g/2L、瓊脂15g/L；

富集及擴大培養(yǎng)基：CH3COONa·3H2O 3g/L、NaCl1g/L、NH4Cl 0.5g/L、MgSO40.2g/L、KH2PO40.5g/L、FeSO40.01g/L、CaCl20.0028g/L、Na2CO30.0157g/L。

1.2方法

1.2.1樣品富集培養(yǎng)

將200mL滅菌后的富集培養(yǎng)基倒入三角瓶中，與底泥攪勻，加入滅菌的液體石蠟以隔絕空氣。置于溫度為28～32℃、光照為2 000～3 000 lux的條件下培養(yǎng)，當(dāng)富集液顏色變紅時，取菌膜及富集液轉(zhuǎn)接入另一裝有富集培養(yǎng)基的100 mL鹽水瓶瓶中培養(yǎng)，接種量為5%～10%，如此轉(zhuǎn)接4～5次。

轉(zhuǎn)基因食品安全問題。2012年湖南轉(zhuǎn)基因大米試驗、孟山都轉(zhuǎn)基因玉米致癌風(fēng)波，2013年“崔方論戰(zhàn)”事件，2014年恒大推出非轉(zhuǎn)基因廣告造勢活動等，一度將轉(zhuǎn)基因食品安全問題推上風(fēng)口浪尖。所以，目前人們最大的關(guān)注點是轉(zhuǎn)基因食品的飲食安全以及生態(tài)安全。

1.2.2分離純化

根據(jù)富集液濃度用1 mL移液管取不同稀釋度的富集液液加到滅菌的試管中，后加入18～20 mL滅菌的40℃光合細菌分離培養(yǎng)基，瓊脂含量0.8%；培養(yǎng)基冷凝后上層加5 mL滅菌的45℃2.0%的瓊脂，用保鮮膜封口。冷卻后置于白熾燈下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，光照強度為2 000～3 000lux，直至長出紅色單菌落。待單菌落長出后用厭氧培養(yǎng)法純化，劃線純化3～4次，鏡檢無雜菌后挑取紅色單菌落至10 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再逐步擴大培養(yǎng)。

1.2.3菌落及菌體形態(tài)觀察

以瓊脂平板上的菌落形態(tài)描述，菌體形態(tài)以電子顯微鏡描述。

1.2.4標準曲線的制作

PSB以10%的接種量接種后，從0～132h開始檢測PSB的OD值的變化情況，36 h前每隔6 h取樣檢測，36 h后每隔4 h取樣檢測變化情況。

1.2.56株P(guān)SB對水體中亞硝酸鹽、氨氮、硫化物的降解作用

試驗分別在水體中添加1g/L的亞硝酸鹽、氨氮及硫化物，實驗組投入10%的PSB，對照組不加PSB菌液，試驗設(shè)3個平行，4 d后測OD值，測定前先將PSB液10000 r/min，10 min離心取上清液測定OD值；

表1　分離菌株的形態(tài)特征

2　結(jié)果與分析

2.1富集分離

對蝦池塘底泥富集7～10天后，培養(yǎng)液變紅，重復(fù)富集,取呈深紅色的富集液進行稀釋,經(jīng)多次半固體培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法獲得6株光合細菌，分別命名為PSB-1、PSB-2、PSB-3、PSB-4、PSB-5、PSB-6。

2.2菌體形態(tài)

2.36株光合細菌的生長曲線

圖1　PSB-1（1000×）　

圖2　PSB-2（1000×）

圖3　PSB-3（1000×）　

圖4　PSB-4（1000×）

圖5　PSB-5（1000×）　

圖6　PSB-5（1000×）

圖7為6株光合細菌的生長趨勢，從圖中可看出6株光合細菌的趨勢是一致的。0～6 h是為遲滯期，6～54 h是對數(shù)生長期，54～132 h是穩(wěn)定期，部分菌株在102 h后出現(xiàn)衰亡。96 h菌株已進入穩(wěn)定期，對各種有害物質(zhì)的降解也趨于穩(wěn)定，故選擇96 h作為檢測光合細菌降解有害物質(zhì)的時間點。

圖7　6株光合細菌生長趨勢

2.4光合細菌對氨氮的降解

實驗結(jié)果表明，11株光合細菌對于培養(yǎng)基中的氨氮都有降解作用，其中PSB-4對氨氮降解能力最強，從401.2 mg/L降解到27.25 mg/L，降解率達到93.21%，其次是PSB-2對氨氮的降解率為58.68%，PSB-5和PSB-6對氨氮的降解率約為55%，PSB-1及PSB-3的降解率約為33%。

圖8　6株光合細菌接種4天后對氨氮的降解

2.5光合細菌對亞鹽的降解

由圖9可知，PSB-1和PSB-2對亞鹽的降解率為99.84%，PSB-3對亞鹽的降解率為 58.94%，PSB-5和PSB-6對亞鹽的降解率約為52%，而菌株P(guān)SB-4反而上升。

2.6光合細菌對硫化物的降解

從圖10可知，PSB-1對硫化物的降解率為50%，PSB-5對硫化物的降解率為44.95%，PSB-2和PSB-6對硫化物的降解低于20%，而PSB-3和PSB-4在接種當(dāng)天快速地降解硫化物，而后又升高，其原因還需要進一步的實驗分析。

圖9　6株光合細菌接種4天后對亞鹽的降解

圖10　6株光合細菌對硫化物的降解

3　小結(jié)與討論

PSB的分離培養(yǎng)常采用厭氧培養(yǎng)法、雙層平板法和半固體試管培養(yǎng)法，光的波長和光照強度對于光合菌培養(yǎng)影響較大。本研究發(fā)現(xiàn)利用厭氧培養(yǎng)法篩選光合細菌的效果優(yōu)于半固體試管法，該方法相對半固體培養(yǎng)法便于挑取單菌落制備液體種子，且比半固體培養(yǎng)法的培養(yǎng)周期短，可能與厭氧程度相關(guān)。

PSB不同菌株的生理功能差異較大。本實驗從池塘底泥及市售樣品中分離篩出6株光合細菌，PSB-3和PSB-4不具備降解硫化物的能力，其余均具有降解氨氮、亞鹽、硫化物的能力，其中PSB-1、PSB-2、PSB-5都具有較好的降解水體中有害物質(zhì)的能力。通過對幾株光合細菌菌株的降解實驗分析，進一步組合復(fù)合菌株。劉敏等在研究混菌發(fā)酵對光合細菌生長及氮磷同化率指出糞紅假單胞菌自身生長能力較沼澤紅假單胞菌強，混菌培養(yǎng)后兩種光合細菌對培養(yǎng)基中氮磷的同化能力明顯增強，較對照組的沼澤紅假單胞菌同化率提高19.89%。

PSB-3及PSB-4對硫化物的利用出現(xiàn)升高的情況，劉磊等在研究光合細菌降解水體中硫化物出現(xiàn)含量升高的情況，原因可能與光合細菌抑制硫化物的作用機制有關(guān)，一是水體環(huán)境中硫酸鹽含量高，硫酸鹽的還原是H2S的主要來源。二是由于氧的供應(yīng)不足，硫蛋白的分解過程產(chǎn)生了H2S。

（略）

S917.1

A

1005-8613（2016）09-0022-03

2016-8-29

劉樣珍，（1989-），女，廣東韶關(guān)，研發(fā)專員，主要從事微生態(tài)制劑研究。