付麗娜

（西安醫(yī)學(xué)院， 陜西 西安 710021）

ABCG2在肺癌干細胞標志中的應(yīng)用價值

付麗娜

（西安醫(yī)學(xué)院， 陜西 西安 710021）

目的：探究分析ABCG2在肺癌干細胞標志中的應(yīng)用價值。方法：采用經(jīng)HE染色、常規(guī)石蠟包埋、切片處理的肺癌組織，并應(yīng)用免疫組化SP法對肺癌組織及肺癌細胞系A(chǔ)459和GLC-82中ABCG2的定位與表達情況進行檢測，通過顯微鏡觀察ABCG2蛋白表達分布的情況及部位，ABCG2蛋白表達強度的陽性單位采用LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。結(jié)果：ABCG2蛋白在肺癌細胞質(zhì)和細胞膜中表達，其中在肺腺癌和鱗腺癌組織中呈現(xiàn)陽性表達，并且分布彌漫，而ABCG2蛋白在肺大細胞癌和肺小細胞癌中不表達。ABCG2蛋白的陽性表達率與表達強度由高到低的排列順序依次為肺腺癌、肺鱗癌、肺小細胞癌和肺大細胞癌，但是各組表達情況對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：ABCG2的在肺癌組織中的表達情況說明ABCG2不適合作為肺癌干細胞的標注物，但是可以作為肺癌分型的標記物。

ABCG2蛋白； 肺癌干細胞； HE染色； 應(yīng)用價值

本文通過應(yīng)用免疫組化SP法觀察肺癌組織中ABCG2蛋白的表達情況，并深入分析了ABCG2表達的分布情況與肺癌組織轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進一步探究了ABCG2是否適合用于肺癌干細胞的標志。

1 材料與方法

1.1 材料選?。哼x取2013年12月至2014年12月期間到我院就診并經(jīng)皮肺穿刺活檢或纖維支氣管鏡組織學(xué)診斷確診為肺癌的患者為研究對象，所選92患者的臨床資料及隨訪治療均完整，其中非小細胞肺癌患者60例，小細胞肺癌患者32例，選取標準：①患者年齡超過18周歲及以上，患者的PS評分≤2分；②患者經(jīng)綜合胸部CT、腹部CT、頭顱MRI檢查后，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟提出的INM分期標準，可見其分為ⅢB期或者Ⅳ期不能接受手術(shù)治療的肺癌患者；③纖維支氣管鏡引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢可以獲得一定大小的塊狀腫瘤組織；④經(jīng)鉑類藥物聯(lián)合化療治療靜脈滴注2周以上；⑤均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肺癌，并具有明顯的臨床病灶。所選患者中男性49例，女性43例，年齡最小的20歲，年齡最大的82歲，平均年齡（60.3±11.7）歲。取患者的肺癌手術(shù)切除標本，將所得標本經(jīng)10%福爾馬林固定，并采用常規(guī)石蠟包埋，確保切片后進行HE染色。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將所取的肺癌組織細胞放在10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的溫度控制在37℃左右，并提供5%二氧化碳飽和濕度。預(yù)先準備好經(jīng)高壓消毒處理的載玻片，并將培養(yǎng)好的細胞接種在載玻片上，采用95%的乙醇進行固定，固定時間在20min左右，觀察接種細胞的生長情況，當接種細胞處于對數(shù)生長期時方可取出載玻片［1］，之后采用0.3%的Triton-X100完成破膜，PBS清洗3，min之后再加入血清封閉處理10min。

1.2.2 免疫化學(xué)染色：一抗為breast cancer resistance protein（ABCG2）鼠抗人BCRP單克隆抗體，并采用乳腺組織進行陽性對照，采用PBS作為一抗空白對照，免疫組化SP法染色的步驟如下：為了完成過氧化物酶的內(nèi)源性阻斷并確保正常羊血清封閉，需要采用1mmoL/L、PH6.0檸檬酸微波以95℃溫度加熱20min，次日加，該羊抗鼠二抗事先經(jīng)生物素標記處理并進行Streptavidin-Peraxidase DAB顯色處理，用于照相記錄的經(jīng)蘇木素復(fù)染，用于圖像定量分析處理的不進行復(fù)染，所染色處理的標本經(jīng)常規(guī)脫水處理，并保持透明、固定封存。

1.3 結(jié)果觀察：顯色程度采用陽性單位（PositiveUnit PU）進行結(jié)果表示，其中培養(yǎng)細胞的細胞膜或者細胞質(zhì)上出現(xiàn)清晰可見的棕黃色或者紅褐色顆粒就表示陽性，PU值越大，說明陽性表達強度越高，PU值越小，說明陽性表達度越低［2］。

1.4 LeicaQ500MC圖像分析：采用LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)，隨機選取從每個樣本中選取10個視野，在40倍物鏡下觀察，每個視野下隨機進行20個陽性癌細胞的檢測，樣本測量的陽性單位樣本細胞中的200個陽性細胞值為標準，按照文獻計算公式計算每個陽性細胞的PU值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，樣本細胞表達的陽性單位PU值采用標準方差（）來表示，多組間數(shù)據(jù)對比采用單因素ANOVA方差分析，兩兩比較采用t檢驗，表達陽性率比較用χ2檢驗或Fisher精確概率法，檢驗水準a=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 ABCG2蛋白在不同組織類型肺癌中的表達情況：ABCG2在不同肺癌組織中的表達程度及陽性率均不同，其中在肺鱗癌組織和肺腺癌組織中均有一定表達，但是在肺大細胞癌和肺小細胞癌中不表達（F原發(fā)灶=6.265，P＜0.05；F轉(zhuǎn)移灶=5.227，P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1及表1、2。

圖1 ABCG2蛋白在不同肺癌組織中的表達情況（A：肺鱗癌B：肺腺癌C肺大細胞D肺小細胞）

表1 ABCG2在不同組織類型肺癌原發(fā)灶中表達的陽性率

表2 ABCG2在不同組織類型肺癌轉(zhuǎn)移灶中表達的陽性率

2.2 ABCG2蛋白在發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達強度：ABCG2蛋白PU表達值在肺鱗癌、肺腺癌、肺大細胞癌和肺小細胞癌等不同細胞組織之間的對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.608，P＜0.05）。其中肺鱗癌和肺腺癌的PU表達值高于肺大細胞癌和肺小細胞癌，兩組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4. 355，P＜0.05）；肺大細胞癌與非小細胞癌之間的PU值表達無統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.284，P＞0.05）。見表3。

表3 ABCG2蛋白在肺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的PU值

3 討 論

近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，肺癌的臨床治療取得了較大的研究進展，但是腫瘤化療治療中的耐藥性仍然是醫(yī)學(xué)工作者面臨的重要問題［3］。肺癌臨床治療中出現(xiàn)的多藥耐藥性與多藥耐藥基因及多藥耐藥蛋白表達增多具有密切關(guān)聯(lián)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)的耐藥蛋白均屬于膜轉(zhuǎn)運體ABC超家族成員。ABCG2蛋白是Doyle等在1998年從乳腺癌細胞MCF-7/AdrVP中發(fā)現(xiàn)的一種藥物轉(zhuǎn)運蛋白，該乳腺癌細胞具有一定的耐藥性，但是并無P-gP和MRP表達，此外，乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）作為一種藥物轉(zhuǎn)運蛋白不僅是ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族的成員之一，還具有ATP依賴性藥物的外排功能。有研究結(jié)果顯示，ABCG2作為ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中的成員，與SP細胞的干細胞成分具有直接的關(guān)聯(lián)性，醫(yī)學(xué)研究中常將ABCG2蛋白作為與SP細胞表達相關(guān)的干細胞篩選標志，但是腫瘤干細胞中的標志物也僅僅是所標記的細胞整體中的極少數(shù)，采用免疫組化學(xué)SP染色標記的細胞呈現(xiàn)簇狀分布，并且細胞數(shù)量較少。本文的研究結(jié)果顯示鱗腺癌組織和肺腺癌組織大部分原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶細胞中的ABCG2蛋白呈現(xiàn)陽性表達，而肺小細胞癌和肺大細胞癌中的ABCG2蛋白并無表達特征。肺癌生物學(xué)行為在醫(yī)學(xué)研究中作為標志，可以為臨床治療提供一定的借鑒價值。HoMM等曾采用熒光標記定量RT-PCR在A549肺癌細胞株H460、H23、HTB-58、A549等中發(fā)現(xiàn)不同程度的ABCG2表達，但是對ABCG2在細胞中的陽性表達率沒有涉及。

ABCG2蛋白作為肺癌干細胞的標志物也不符合蛋白標志物的表達特征，在不同的癌細胞組織中呈現(xiàn)不同程度的陽性表達。因此，ABCG2蛋白并不能作為肺癌干細胞標志物，但是根據(jù)ABCG2在干細胞表達中的陽性率，可以將其作為肺癌分型的標志物，該理論研究還有待深入分析，可見其作為ABCG2蛋白的未來研究方向之一。

［1］ 夏暉，于長海，張文，等.人肺癌A549細胞系腫瘤干細胞的篩選和鑒定［J］.中國肺癌雜志，2013，12（8）：400～404.

［2］ 潘振華，Qinghua ZHOU.側(cè)群細胞與肺癌腫瘤干細胞［J］.中國肺癌雜志，2012，15（3）：187～190.

［3］ 何進喜，宋旭梅，于亮，等.在順鉑耐藥的A549/DDP人肺腺癌細胞中乙醛脫氫酶表達增加［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，（5）：625～629.

Application Value of ABCG2 in Lung Cancer Stem Cell Marker

FU Lina
（Xi'an Medical College，Shanxi Xi'an710021，China）

Objective：To explore the analysis of ABCG2 sign the application value in lung cancer stem cells.Methods：By HE staining，normal paraffin embedding，sectioning treatment of lung cancer，and using immunohistochemical SP method for lung cancer and lung cancer cell line A459 and GLC-82 in the localization and expression profile of ABCG2 detection，through a microscope to observe the distribution of the ABCG2 protein expression and parts，ABCG2 protein expression intensity of positive unit adopts LeicaQ500MC image analysis system for quantitative analysis.Results：The expression of ABCG2 protein in lung cancer in the cytoplasm and cell membrane was positive，which in lung adenocarcinoma and squamous adenocarcinoma tissues positive expression，and distribution，and ABCG2 protein in lung large cell carcinoma，and no expression in carcinoma of the lung.ABCG2 protein positive expression rate and expression intensity of the order from high to low in turn of lung adenocarcinoma，lung squamous carcinoma，small cell lung cancer and pulmonary large cell carcinoma，but the expression in the difference was not significant（P＞0.05）.Conclusion：The ABCG2 expression in lung cancer tissue case ABCG2 is not suitable for lung cancer stem cells as a mark，but can be used as markers for lung cancer classification.

ABCG2 protein； Lung cancer stem cells； HE staining； Application value

陜西省科技廳面上資助項目，（編號：2015JM8442）

1006-6233（2016）09-1513-04

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.09.045