鄭瀟然,李前寬,李建輝,王　翔,錢　浩,王新杰,李建華

(1. 承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000;2. 河北省承德市中心醫(yī)院暨承德醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,河北 承德 067000)

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DC-CIK聯(lián)合鉑類化療治療乳腺癌療效及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用研究

鄭瀟然1,李前寬1,李建輝2,王翔2,錢浩2,王新杰2,李建華2

(1. 承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000;2. 河北省承德市中心醫(yī)院暨承德醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,河北 承德 067000)

目的觀察樹突細(xì)胞(DC)及殺傷細(xì)胞(CIK)共同培育出的DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合鉑類化療對(duì)乳腺癌患者的臨床療效及對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力。方法將84例乳腺癌術(shù)后患者隨機(jī)分為2組。觀察組采用DC-CIK聯(lián)合鉑類化療，對(duì)照組采用單純化療，觀察2組臨床療效及癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果觀察組治療后及治療后1個(gè)月各免疫細(xì)胞水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；2組治療期間不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組有效率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)及總生存期(OS)時(shí)間均明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P均<0.05)；DC-CIK細(xì)胞比CIK細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷能力(P<0.05)。結(jié)論DC-CIK聯(lián)合鉑類化療治療乳腺癌臨床療效好，對(duì)癌細(xì)胞殺傷作用較強(qiáng)，能提升患者的免疫能力，延長(zhǎng)患者壽命。

乳腺癌；DC-CIK；順鉑

乳腺癌為婦女常見疾病，其發(fā)病率逐年上升，成為威脅女性健康的首位腫瘤。目前，乳腺癌的治療仍以手術(shù)與放化療相結(jié)合的方式，但放化療的療效不夠穩(wěn)定。最近生物靶向治療飛速發(fā)展，有望成為治療乳腺癌的主流方法之一。經(jīng)研究證實(shí)，樹突細(xì)胞(DC)及其細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)共同培養(yǎng)出的DC-CIK細(xì)胞是新興抗腫瘤免疫治療的首選[1]，由于二者的共同培養(yǎng)，使得DC細(xì)胞分泌的IL-2、IL-12等多種細(xì)胞因子作用于CIK細(xì)胞，促進(jìn)其成熟，產(chǎn)生新型DC-CIK細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷效果。本研究采用DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合鉑類化療藥治療乳腺癌，探討其對(duì)免疫功能的影響及對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料選取2011年2月—2014年5月在承德市中心醫(yī)院就診女性乳腺癌術(shù)后患者84例，均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)病理證實(shí)，預(yù)計(jì)生存時(shí)間>1年；KPS評(píng)分>60分；無(wú)不良生活習(xí)慣，無(wú)其他惡性腫瘤史，無(wú)心、肝、肺、腎等重要器官嚴(yán)重慢性疾病史；術(shù)前未接受其他抗腫瘤治療。排除兒童期乳腺癌、哺乳期乳腺癌以及乳腺癌已轉(zhuǎn)移或合并其他器官惡性腫瘤者。將患者隨機(jī)分為2組：觀察組42例，年齡42～67(51.83±6.29)歲，體質(zhì)量54～68(58.68±5.19)kg,已絕經(jīng)21例。對(duì)照組42例，年齡41～66(50.27±6.72)歲，體質(zhì)量51～71(56.71±6.23)kg,已絕經(jīng)17例。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1主要儀器及試劑貝克曼公司流式檢測(cè)試劑盒，BD公司流式細(xì)胞儀，F(xiàn)resenius公司血細(xì)胞分離機(jī)，上海立菲公司培養(yǎng)基，奧林巴斯公司倒置相差顯微鏡，賽默公司CO2培養(yǎng)箱。上海克隆公司GM-CSF、IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-1試劑，北京雙鷺公司CD3單抗、IL-2試劑，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液。

1.2.2制備DC-CIK采集患者外周血3×109個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分離液分離之，培養(yǎng)液洗滌2次。一部分采用10%胎牛血清、1 000 IU/mL IFN-γ和IL-2、CD3單抗和IL-1 0.5 μg/mL的CIK細(xì)胞培養(yǎng)基以3×106mL-1的濃度重懸，放入37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中，于第4天以1 000 IU/mL IL-2的擴(kuò)液瓶傳代，第8天可收集CIK細(xì)胞。另一部分以1640無(wú)血清培養(yǎng)液以6×106mL-1濃度重懸，入培養(yǎng)瓶，在37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培育2 h，后棄上清，使用培養(yǎng)液濾瓶2次，加入濃度同為1 000 IU/mL GM-CSF 和IL-4的DC細(xì)胞培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中，并于第3日補(bǔ)加培養(yǎng)基。第5天加入肝癌組織凍融抗原，使之濃度達(dá)到80 g/mL，第6天加入TNF-α使之濃度處于1 000 IU/mL，第8天收集DC細(xì)胞。將DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞以1∶5比例合并，繼續(xù)培養(yǎng)5 d。

1.2.3治療方案對(duì)照組術(shù)后給予單純化療：環(huán)磷酰胺(齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20093077)1.5 g/m2靜脈注射，連用5 d；順鉑(齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20073653)25 mg/m2靜脈注射，連用5 d。觀察組在化療前采集外周血單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行DC-CIK細(xì)胞的制備，待培養(yǎng)完成后進(jìn)行回輸?；剌敳捎渺o脈途徑，每次時(shí)間小于30 min，分6次進(jìn)行，每天1次。此外，觀察組在采集單個(gè)核細(xì)胞后，聯(lián)合順鉑化療，用法及劑量同對(duì)照組。2組在治療期間均予以相應(yīng)改善貧血、營(yíng)養(yǎng)、護(hù)肝等常規(guī)治療。

1.3觀察指標(biāo)①免疫功能：監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群評(píng)價(jià)患者免疫功能變化，主要包括總T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞(輔助性T細(xì)胞)、CD8+T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)及NK細(xì)胞。②臨床療效：以RECIST標(biāo)準(zhǔn)[2-3]評(píng)價(jià)臨床療效，分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定和進(jìn)展，完全緩解及部分緩解記為治療有效。③治療安全性：將不良反應(yīng)發(fā)生率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。④預(yù)后情況：治療后復(fù)查CT，電話隨訪，記錄患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期(截止2015年5月)。⑤DC-CIK細(xì)胞與CIK細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷活性：收集制備的DC-CIK細(xì)胞及CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以乳腺癌細(xì)胞株MCF7/ADR作為靶細(xì)胞，靶細(xì)胞濃度設(shè)置為1×105mL-1，調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞密度使效靶比分別為10∶1,20∶1,40∶1，以未反應(yīng)的細(xì)胞作空白對(duì)照，采用MTT法測(cè)出光密度，分析得出殺傷率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果采用EXCEL進(jìn)行匯總，使用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理、分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.12組治療前后免疫功能比較治療前2組各免疫細(xì)胞水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；觀察組治療后及治療后1個(gè)月各免疫細(xì)胞水平均明顯高于治療前及對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

2.22組臨床效果比較觀察組有效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表1　2組不同時(shí)點(diǎn)免疫細(xì)胞水平比較±s，%)

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對(duì)照組比較，P<0.05。

表2　2組臨床效果比較

注：①與對(duì)照組比較，2=4.94,P<0.05。

2.32組不良反應(yīng)情況比較2組治療期間不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　2組不良反應(yīng)情況

注：①與對(duì)照組比較，2=0.08,P>0.05。

2.42組預(yù)后情況比較觀察組無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期均顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P均<0.05)。見表4。

表4　2組生存情況比較±s,月)

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.5DC-CIK細(xì)胞與CIK細(xì)胞對(duì)耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR細(xì)胞殺傷活性比較2組細(xì)胞的殺傷活性均隨著效靶比的升高而提高(P均<0.05)；同效靶比，DC-CIK細(xì)胞比CIK細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷能力(P<0.05)。見表5。

3　討　　論

乳腺癌是最常見也是最嚴(yán)重的乳房疾病，多見于50歲左右絕經(jīng)前后的婦女，近年其發(fā)病率逐漸上升，越來(lái)越多的年輕婦女也患上乳腺癌，給女性身心健康帶來(lái)負(fù)面影響，也給家庭和社會(huì)造成了很大的負(fù)擔(dān)。乳腺癌的治療目前仍以手術(shù)為主，常規(guī)化療方案一般在術(shù)后進(jìn)行，以清除病變周圍淋巴結(jié)手術(shù)無(wú)法切除的微小轉(zhuǎn)移灶，近年來(lái)術(shù)前及術(shù)中化療越來(lái)越普遍，目的是縮小原發(fā)病灶使腫瘤降期以及減少手術(shù)操作帶來(lái)的醫(yī)源性轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，在臨床中，為使腫瘤細(xì)胞清除徹底，化療藥物劑量往往較大，易引起骨髓抑制、嘔吐、腹瀉、便秘、脫發(fā)、發(fā)熱、皮疹等不良反應(yīng)，某些患者難以接受，此外，部分腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物還顯示出較大的耐藥性，因此術(shù)后單用化療有時(shí)不能達(dá)到預(yù)期效果[4-5]。

表5　2組細(xì)胞對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的殺傷活性

注：①與同組低一級(jí)比例比較，P<0.05；②與CIK細(xì)胞比較，P<0.05。

DC-CIK抗腫瘤療法是最近幾年研究的熱點(diǎn)。CIK細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用下產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞，擁有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性，同時(shí)也具備NK細(xì)胞清除癌細(xì)胞作用的廣泛性，體外培養(yǎng)10 d以上的CIK細(xì)胞，增殖和活性均達(dá)到頂峰，選擇此時(shí)的CIK細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)用，抗腫瘤效應(yīng)更強(qiáng)，且不需要大劑量持續(xù)的白細(xì)胞介素-2來(lái)維持，是目前腫瘤免疫治療的主要選擇之一[6-7]。DC細(xì)胞與人體含量較少，多采用骨髓血或外周血于體外在多種細(xì)胞因子作用下誘導(dǎo)生成，因其能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量CTL、介導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞作用于腫瘤組織、阻止腫瘤血管的生成減少腫瘤血供，成為腫瘤免疫治療的主要方法，對(duì)黑色素瘤、腎癌應(yīng)用效果較高，對(duì)其他常見腫瘤也有不錯(cuò)的療效。近年研究發(fā)現(xiàn)，DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)可明顯提升兩者繁殖能力，對(duì)CIK細(xì)胞的活性也有不錯(cuò)的增強(qiáng)效果[8]。DC-CIK細(xì)胞比CIK細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷能力，提示DC細(xì)胞能提升CIK細(xì)胞的殺瘤性能，其主要機(jī)制為DC細(xì)胞外部的樹狀突起增加了其接觸面積，有助于與抗原的反應(yīng)，再將抗原提呈給CIK細(xì)胞。DC對(duì)MHCⅠ、Ⅱ分子及CD80、CD60的高表達(dá)作用，刺激CIK細(xì)胞活性的增加，同時(shí)由DC細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子如IL-2、IL-12等，能促進(jìn)CIK細(xì)胞的成熟，產(chǎn)生大量IFN-γ、誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，提高癌細(xì)胞的清除效率[10]。

由于腫瘤的進(jìn)展和消退都與患者自身的免疫狀態(tài)有關(guān)，免疫功能越強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用越大，而免疫功能越弱，對(duì)癌細(xì)胞限制作用越小，腫瘤進(jìn)展加快。對(duì)癌細(xì)胞的殺傷過(guò)程通過(guò)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，因此T淋巴細(xì)胞亞群也反映了患者抗腫瘤的能力。本研究結(jié)果顯示,觀察組治療后及治療后1個(gè)月各免疫細(xì)胞水平明顯高于治療前及同期對(duì)照組，說(shuō)明DC-CIK聯(lián)合化療能顯著提升患者的T淋巴細(xì)胞亞群，提高免疫能力，增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用；觀察組有效率及患者無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期時(shí)間高于對(duì)照組，表明DC-CIK聯(lián)合化療治療乳腺癌臨床療效好，能降低乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的概率，延長(zhǎng)患者的存活時(shí)間。2組不良反應(yīng)差別不大，均處于較低水平，說(shuō)明DC-CIK療法并未增加不良反應(yīng)的發(fā)生率，較安全。

綜上所述，DC-CIK聯(lián)合鉑類化療治療乳腺癌安全有效，對(duì)癌細(xì)胞殺傷作用較強(qiáng)，能提升患者的免疫能力，延長(zhǎng)患者生命，可為各位同道所參考。

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李建華，E-mail:lj_hua1963@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.30.018

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1008-8849(2016)30-3357-03

2016-01-14