姚　樂，李　梅，王朝霞，高鳳成，畢建紅，康　凱，安　毅

(1. 陜西省榆林市第一醫(yī)院(榆林院區(qū))，陜西 榆林 719000；2. 陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西 西安 710061)

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大鼠肝纖維化進(jìn)程中AT1R/MasR的動(dòng)態(tài)變化

姚樂1，李梅2，王朝霞1，高鳳成1，畢建紅1，康凱1，安毅1

(1. 陜西省榆林市第一醫(yī)院(榆林院區(qū))，陜西 榆林 719000；2. 陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西 西安 710061)

目的研究大鼠肝纖維化進(jìn)程中肝臟AT1R、MasR水平及AT1R/MasR的動(dòng)態(tài)變化。方法將36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)為正常組8只和模型組28只，模型組采用四氯化碳(CCl4)制備大鼠肝纖維化模型，正常組給予腹腔注射等量的生理鹽水，分別在干預(yù)第2，4，6，8周取各組大鼠肝組織進(jìn)行HE和Masson三色染色，觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化情況，并采用Western blot法檢測(cè)肝組織勻漿中AT1R、MasR蛋白表達(dá)情況。結(jié)果隨著時(shí)間延長(zhǎng)，模型組大鼠肝纖維化程度逐漸加重；在大鼠肝纖維化進(jìn)程中，肝組織中AT1R、MasR蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)；第2，4周，模型組AT1R/MasR比值明顯低于正常組(P均<0.05)，而第6周模型組其比值高于正常組及第4周時(shí)(P<0.05)，第8周時(shí)該比值明顯高于第6周時(shí)(P<0.05)。結(jié)論AT1R、MasR均參與大鼠肝纖維化形成。

肝纖維化；血管緊張素Ⅱ1型受體；血管緊張素(1-7)受體

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化的共同病理基礎(chǔ)，而肝內(nèi)經(jīng)典腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活與肝纖維化發(fā)展密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，經(jīng)典ACE-AngⅡ-AT1R軸的激活可以促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[1]，而ACE2-Ang(1-7)-MasR軸是RAS中新發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)生理學(xué)分支，該軸對(duì)經(jīng)典ACE-AngⅡ-AT1R軸具有拮抗作用，即可抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。雖然兩條軸精確的生理學(xué)機(jī)制還不十分清楚，但可以肯定，RAS系統(tǒng)平衡的關(guān)鍵是AngⅡ、Ang(1-7)[2-3]，它們作用的受體是AT1R、MasR，所以AT1R、MasR在肝纖維化的進(jìn)程中扮演著舉足輕重的角色。但在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中AT1R、MasR是如何相互作用的，其變化趨勢(shì)如何，目前研究尚少。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠肝纖維化進(jìn)程中AT1R、MasR水平及其比值的變化，探討AT1R、MasR與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，試圖為肝纖維化的發(fā)生機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1動(dòng)物清潔級(jí)雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g；由延安大學(xué)動(dòng)物科學(xué)研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(陜)-2013-004號(hào)。實(shí)驗(yàn)過程符合中華人民共和國的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及倫理要求，實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑及儀器CCl4購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；AT1R、MasR一抗購自Santa Cruz公司；PVDF膜、二抗堿性磷脂酶標(biāo)記羊抗兔IgG、哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑、ECL顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；Alpha多功能數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)(protein simple公司生產(chǎn))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組及肝纖維化大鼠模型的制備將36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)為正常組8只和模型組28只。模型組采用CCl4制備大鼠肝纖維化模型，即腹腔注射50%CCl4-橄欖油混懸溶液(體積比為CCl4∶橄欖油=1∶1 )，0.15 mL/100 g，每周3次，共計(jì)8周；正常組給予腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3.2標(biāo)本獲取分別在注射2，4，6，8周后，模型組隨機(jī)挑選7只大鼠、正常組隨機(jī)挑選2只大鼠，稱體質(zhì)量后，25%烏拉坦麻醉取出肝臟，于10%甲醛中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.3.3病理組織學(xué)觀察取部分肝左葉組織，并以5 μm的厚度連續(xù)切片，二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇至水、蘇木精染色5 min、自來水洗3 min、1%鹽酸乙醇30 s、自來水洗3 min、1%氨水30 s、伊紅染色1 min、二甲苯透明和中性樹膠封片。行HE與Masson三色染色，然后光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化情況。

1.3.4組織蛋白提取取部分肝左葉組織，按1 g∶10 mL加入組織蛋白提取試劑，勻漿，4 ℃孵育2 h，12 000 g離心5 min，收集上清置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5肝組織勻漿AT1R、MasR蛋白水平測(cè)定采用Western blot法，將40 μg組織蛋白和2×上樣buffer混合后進(jìn)行SDS-聚丙烯胺凝膠電泳。將電泳后的蛋白半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%胎牛血清常溫封閉2 h后，加入AT1R、MasR一抗4 ℃孵育過夜。PVDF膜清洗3次后加二抗孵育2 h。經(jīng)ECL顯色劑顯色，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)成像。

2　結(jié)　　果

2.1病理學(xué)表現(xiàn)正常組光鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊有序，肝索排列整齊，見圖1。模型組肝組織 HE 染色光鏡顯示:隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肝纖維化程度逐漸加重，第2周肝小葉結(jié)構(gòu)可辨，肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微的脂肪變性，局部匯管區(qū)內(nèi)可見結(jié)締組織增生，見圖2；第4周肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，發(fā)現(xiàn)脂肪變性的細(xì)胞中出現(xiàn)大小不等脂滴，見圖3；第6周有病變的區(qū)域明顯增多，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，門管區(qū)周圍膠原纖維沉積形成纖維間隔，小葉結(jié)構(gòu)被破壞，見圖4；第8周時(shí)假小葉開始形成，且出現(xiàn)肝細(xì)胞變性、壞死，胞質(zhì)疏松、膠原沉積，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原沉積范圍逐漸擴(kuò)大，見圖5。正常組大鼠肝組織病理分期均為S0期；第2周，模型組肝組織病理分期S0期6只，S1期1只；第4周，模型組肝組織病理分期S1期5只，S2期2只；第6周，模型組肝組織病理分期S1期2只，S2期2只，S3期3只；第8周，模型組肝組織病理分期S2期2只，S3期5只。

圖1　正常組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)

圖2　模型組第2周肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)

圖3　模型組第4周肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)

圖4　模型組第6周肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)

2.2肝組織中AT1R、MasR蛋白表達(dá)水平隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，模型組AT1R、MasR蛋白表達(dá)水平呈逐漸上升趨勢(shì)，后一組與前一組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；造模第2，4周，AT1R/MasR比值明顯低于正常組(P均<0.05)；造模第6周時(shí)，AT1R/MasR比值明顯高于第2，4周及正常組(P均<0.05)；造模第8周時(shí)，AT1R/MasR比值明顯高于造模第6周時(shí)(P<0.05)。見圖6及表1。

圖5　模型組8周肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)

1為正常組；2為模型第2周組；3為模型第4周組；4為模型第6周組；5為模型第8周組

項(xiàng)目正常組模型組第2周第4周第6周第8周AT1R0.45±0.070.63±0.05①0.76±0.05①②1.62±0.05①③2.07±0.05①④MasR0.31±0.040.37±0.04①0.45±0.04①②0.54±0.04①③0.67±0.05①④AT1R/MasR2.11±0.402.07±0.27①1.98±0.32①2.74±0.25①③2.98±0.42①④

注：①與正常組比較，P<0.05；②與第2周比較，P<0.05；③與第4周比較，P<0.05；④與第6周比較，P<0.05。

3　討　　論

大量證據(jù)表明，血管緊張素原在腎素作用下形成AngⅠ，ACE促使無活性的AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ，并作用于AT1R，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化增殖，引起細(xì)胞外基(ECM)過度沉積，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[4]。AT1R是經(jīng)典RAS軸的關(guān)鍵受體，在肝纖維化進(jìn)程中，RAS被逐漸激活，AT1R的表達(dá)逐漸增多[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了AT1R在肝纖維化發(fā)展過程中的促進(jìn)作用。

近年發(fā)現(xiàn)了RAS家族中的新軸，即ACE2-Ang(1-7)-MasR軸，它的發(fā)現(xiàn)增加了RAS系統(tǒng)的復(fù)雜性。ACE2是RAS系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，能高效地將AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang(1-7)，Ang(1-7)再與其特異性受體MasR結(jié)合，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用[6]。目前認(rèn)為，ACE2-Ang(1-7)-MasR軸是經(jīng)典RAS軸的反向調(diào)節(jié)體系，對(duì)肝纖維化具有保護(hù)作用[7]，該軸有可能為肝纖維化的治療提供新思路。

Osterreicher等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ACE2基因敲除小鼠與野生小鼠相比表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的肝纖維化，證實(shí)了ACE2與Ang(1-7)的抗纖維化作用。Herath等[9]發(fā)現(xiàn)在膽管結(jié)扎肝纖維化動(dòng)物模型及人丙型肝炎纖維化的肝臟中，MasR基因表達(dá)上調(diào)，肝纖維化程度減輕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了隨著肝纖維化的進(jìn)展，MasR表達(dá)增強(qiáng)，發(fā)揮拮抗經(jīng)典RAS軸的作用。

另有研究證實(shí)，肝臟病變時(shí)兩條軸各組分均過度表達(dá)，ACE、AngⅡ生成增多代償性引起AT1R/MasR比例升高，從而導(dǎo)致HSC活化增殖[10]；AT1R/MasR降低則可引起抗增殖的作用[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第2，4周模型組AT1R/MasR明顯低于正常組，可能與在肝纖維化早期MasR拮抗作用較強(qiáng)有關(guān)，推測(cè)這是RAS維持系統(tǒng)平衡的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，即對(duì)過度激活的經(jīng)典RAS軸的拮抗反應(yīng)；第6周模型組AT1R/MasR增高，第8周時(shí)該比值明顯增高，可能由于致病因子(CCl4)的持續(xù)存在，進(jìn)一步激活RAS系統(tǒng)，進(jìn)而ACE、AngⅡ、AT1R生成增多，AngⅡ增高又可下調(diào)ACE2的水平，使AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang(1-7)的量降低，從而對(duì)MasR的誘導(dǎo)作用減弱，最終導(dǎo)致RAS系統(tǒng)失平衡，促進(jìn)肝纖維化形成[10，12]。

綜上所述，AT1R、MasR在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，它們?cè)谠缙谙嗷タ购?，以維持AT1R與MasR的平衡，但最終以AT1R作用占優(yōu)勢(shì)而導(dǎo)致肝纖維化的形成。在肝纖維化形成過程中，RAS各組分發(fā)揮的作用以及它們之間的相互作用關(guān)系目前還不十分明確，仍待進(jìn)一步研究證實(shí)，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床肝纖維化的發(fā)生機(jī)制及臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。

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Dynamic changes of AT1R/MasR in the process of rat liver fibrosis

YAO Le1, LI Mei2, WANG Zhaoxia1, GAO Fengcheng1, BI Jianhong1, KANG Kai1, AN Yi1

(1.The First Hospital of Yulin, Yulin 719000, Shaanxi, China; 2.Shaanxi Provincial Tumor Hospital, Xi’an 710061, Shaanxi, China)

Objective It is to investigate the levels of Angiotensin II type 1 receptor (AT1R) and Angiotensin (1-7) receptor (MasR), and the dynamic changes of AT1R/MasR in the process of rat liver fibrosis. Methods 36 male Winstar rats were randomly divided into model group and normal group, 28 rats in the model group were used to prepare rat liver fibrosis model induced by subcutaneous injection of CCl4, and 8 rats in the normal group were treated with intraperitoneal injection of normal saline. 7 rats in the model group and 2 rats in the normal group were killed to get the liver tissue for hematoxylin-eosin (HE) and Masson trichrome staining after treatment for 2-, 4-, 6- and 8-week respectively, the changes of liver tissue structure were observed, and the protein expression of AT1R and MasR in liver homogenate were detected by Western blot analysis. Results The degree of hepatic fibrosis in model group were increased gradually with time. In the process of liver fibrosis, the expression level of AT1R and MasR in liver tissue was increased. In the model group, the AT1R/MasR values in the second weeks and the forth weeks were significantly lower than that of the normal group (allP<0.05), while those of the model group in the sixth weeks was significantly higher than that in the forth weeks and of the normal group (allP<0.05), and in the eighth weeks was significantly higher than that in the sixth weeks (P<0.05). Conclusion The occurrence and development of hepatic fibrosis are possibly associated with imbalances between AT1R and MasR.

hepatic fibrosis; Angiotensin II type 1 receptor; Angiotensin (1-7) receptor

姚樂，女，主治醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)橄滥[瘤防治。

康凱，E-mail:965569542@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.30.010

R-332

A

1008-8849(2016)30-3336-04

2016-06-10