郭光禮，張云香，王麗萍，張 康，張 麗，王洪偉，于建敏，李金平，龔振華

1. 臨朐縣畜牧局，山東臨朐　262600；2. 臨朐縣職業(yè)教育中心學校，山東臨朐　262600；3. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島　266109；4. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州　730050；5. 諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東諸城　262200；6. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島　266032）

?

部 分集約化養(yǎng)禽場肉雞馬立克氏病橫斷面調(diào)查

郭光禮1，張云香2，王麗萍3，張 康4，張 麗5，王洪偉5，于建敏6，李金平6，龔振華6

1. 臨朐縣畜牧局，山東臨朐262600；2. 臨朐縣職業(yè)教育中心學校，山東臨朐262600；3. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島266109；4. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050；5. 諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東諸城262200；6. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032）

為了解肉雞馬立克氏病的流行特征，從6個集約化養(yǎng)殖場隨機選擇未免疫馬立克氏病疫苗的20日齡和45日齡肉雞各360只，分別采集其羽髓和血清樣品，用瓊脂免疫擴散試驗和PCR試驗進行馬立克氏病檢測。瓊脂免疫擴散試驗檢測結(jié)果為：20日齡肉雞馬立克氏病陽性率為3.33%～6.67%，45日齡肉雞馬立克氏病陽性率為5.00%～8.33% ；PCR試驗檢測結(jié)果為：20日齡肉雞馬立克氏病陽性率為5.00%～10.00%，45日齡肉雞馬立克氏病陽性率為8.33%～13.33%。統(tǒng)計這兩種試驗均為陽性的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示20日齡肉雞雙陽性率為3.33%～5.00%，45日齡肉雞雙陽性率為5.00%～6.67%。檢測結(jié)果表明，所調(diào)查的肉雞群存在一定的馬立克氏病感染，提示要加強肉雞馬立克氏病防疫，降低其感染發(fā)病率。

馬立克氏病；流行病學調(diào)查；瓊脂免疫擴散試驗；PCR試驗

馬立克氏?。?Marek's Disease，MD）由皰疹病毒科B亞群的馬立克氏病病毒（Marek′s disease virus，MDV）引起。感染MDV的雞呈現(xiàn)淋巴組織細胞惡性增生，其內(nèi)臟器官、外周神經(jīng)、肌肉、性腺、虹膜和皮膚中出現(xiàn)單核細胞浸潤，并形成腫瘤病變［1］。MD遍布全世界各養(yǎng)雞地區(qū)，受害雞群發(fā)病率從1%至30%不等，有時高達60%，乃至全群死亡，已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一［2］。從20世紀70年代開始，全球推廣使用MD疫苗，使得該病得到了一定程度的控制［3］。其中，美國通過對包括肉雞在內(nèi)的所有商品雞進行大規(guī)模疫苗接種，使得MD總發(fā)病率只有0.012%［4］。國內(nèi)多數(shù)商品肉雞未接種MD疫苗，很多雞場也缺少針對MD的防制措施，存在暴發(fā)MD的潛在威脅［5-6］。開展國內(nèi)肉雞MD調(diào)查，分析掌握肉雞MD的流行現(xiàn)狀，對于進一步采取有效措施預防MD尤為重要。本研究采用瓊脂免疫擴散試驗（AGID）和PCR試驗方法，對從6個集約化肉雞養(yǎng)殖場采集的720份血清和720份羽髓樣品進行了MD調(diào)查，掌握了這些集約化肉雞養(yǎng)殖場MD的流行特征，對該病的防控具有重要的參考意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑。DNA純化試 劑盒、Taq DNA 聚合酶、瓊脂板、DL2000 M arker均購自康為世紀公司；雞MDV SD2012毒株由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心提供；抗原和 MDV標準陽性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2被檢樣品。被檢樣品來源于某地區(qū)的6個集約化商品肉雞場，養(yǎng)殖規(guī)模為10萬～75萬只，存欄量為2萬～15萬只。據(jù)了解，所采樣的商品肉雞均未進行MD疫苗免疫。本調(diào)查在每個肉雞場隨機選擇20日齡肉雞60只，45日齡肉雞60只。對于選定的每只雞，分別采集其血清樣品和羽髓樣品，并進行對應標注。從6個肉雞場共采集720份血清和720份羽髓樣品。樣品采集后低溫保存，送實驗室，立即進行MD檢測。

1.1.3PCR引物。采用文獻［7］報道的擴增MDV meq基因引物，Meq F：5′-GGCACGGTACAGGTG TAAAGAG-3′；Meq R：5′-GCATAGACGATGTGC TGCTGAG-3′。預期片段大小為1 081 bp。

1.2方法

1.2.1瓊脂免疫擴散試驗。取被檢血清樣品，進行MD瓊脂免疫擴散試驗，于37 ℃作用 48 h 后觀察結(jié)果。

1.2.2PCR試驗。取被檢羽髓樣品，提取樣品的DNA，進行PCR試驗。反應條件為95 ℃ 5 min 預變性，94 ℃ 1 min 變性、53 ℃ 1 min退火、72 ℃2 min 延伸，35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min完全延伸。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2　結(jié)果

6個肉雞場20日齡肉雞瓊脂免疫擴散試驗檢測的MD平均陽性率為4.72%，45日齡肉雞的平均陽性率為5.28%。

用PCR試驗可擴增出1 081 bp的陽性片段。6個養(yǎng)雞場20日齡肉雞的MD平均陽性率為8.05%，45日齡肉雞的平均陽性率為10.28%。

對瓊脂免疫擴散試驗結(jié)果和PCR試驗結(jié)果進行統(tǒng)計，挑選出兩種試驗結(jié)果均為陽性的樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20日齡肉雞的MD平均雙陽性率為4.16%，45日齡肉雞的平均雙陽性率為5.84%。

720份血清樣品的MDV瓊脂免疫擴散試驗、720份羽髓樣品PCR試驗的檢測結(jié)果，以及雙陽性的詳細檢測結(jié)果見表1。

3　討論

本研究結(jié)果表明，該地區(qū)所調(diào)查的6個集約化商品肉雞場均存在不同程度的MD野毒感染。這是因其肉雞MD瓊脂免疫擴散試驗檢測陽性率為3.33%～8.33%，PCR試驗檢測陽性率為5.00%～13.33%，且瓊脂免疫擴散試驗和PCR試驗檢測結(jié)果的雙陽性率為3.33%～6.67%，而這6個集約化商品肉雞場均未進行過MD疫苗免疫，不存在因疫苗所致的抗體或病毒陽性。

超強MDV對于肉雞的危害已有報道，感染雞的年齡越小，發(fā)生MD的時間就越早，發(fā)病率就會更高，出現(xiàn)早期死亡綜合征的比例也會更高［8］。MDV感染肉雞后，還會引起免疫抑制，影響肉雞的生產(chǎn)性能，導致患病雞群飼料報酬降低、藥費增加及屠體品質(zhì)不佳［9］。本研究結(jié)果表明，調(diào)查的6個肉雞養(yǎng)殖場，經(jīng)PCR試驗和瓊脂免疫擴散試驗檢測均存在陽性，其中，20日齡肉雞的MD陽性率最高的達10.00%，提示MD感染將給這些肉雞養(yǎng)殖場帶來較大經(jīng)濟損失。

表1　MD瓊脂免疫擴散試驗和PCR試驗檢測結(jié)果

MDV對雞的感染性與雞的年齡有關(guān)，雞齡越小，MDV對其越敏感［10-11］。本研究中，經(jīng)PCR試驗檢測，20日齡肉雞的MDV陽性率高達10.00%，45日齡肉雞的MDV陽性率仍繼續(xù)上升，最高的達 13.33%，說明MDV污染對于空白未免疫雞群的危害普遍、持久。

雞群感染MDV后，通常在8～10周以后出現(xiàn)較為明顯的特征癥候群。商品肉雞的飼養(yǎng)期一般在6～7周，在其飼養(yǎng)期內(nèi)難以觀察到典型的MD，因此商品肉雞MD在許多國家和地區(qū)沒有得到足夠的認識［8，10］。國內(nèi)在MD的防疫中也同樣存在一定誤區(qū)。一些肉雞養(yǎng)殖戶由于肉雞飼養(yǎng)周期短，MD發(fā)病不明顯，僥幸認為肉雞在出欄前不會發(fā)生MD，疏于防范，這可能是MD在我國流行的一個重要原因。本研究結(jié)果提示，肉雞在出欄前的飼養(yǎng)過程中也要加強防范MDV的感染，加強飼養(yǎng)管理，做好疫苗防疫工作。

瓊脂免疫擴散試驗和PCR試驗可用于MD檢測［12-13］。瓊脂免疫擴散試驗操作簡便，成本較低，但檢測靈敏性相對較低；而PCR試驗操作相對復雜，成本較高，但檢測靈敏性相對較高。本研究結(jié)果表明，瓊脂免疫擴散試驗和PCR試驗均可用于MD的監(jiān)測，可以根據(jù)實際情況與不同要求，選擇不同的方法進行MD監(jiān)測與分析。

［1］ 龔振華，李葳，劉國慶，等.淺談馬立克氏病防治研究進展［J］. 中國動物檢疫，2009，26（8）：66-69.

［2］Bulow V V，Biggs P M. Differentiation between strains of Marek's disease virus and turkey herpesvirus by immunofluorescence assays［J］. Avian Pathol，1975，4：133-146.

［3］ Witter R L，Sharma J M， Fadly A M， et al. Pathogenicity of Variant Marek's Disease Virus Isolants in Vaccinated and Unvaccinated Chickens［J］. Avian Diseases，1980，24：210-232.

［4］ 黃燁. 梅里亞禽病防制專題 美國肉雞應用馬立克氏病疫苗的經(jīng)驗—肉雞接種馬立克氏病疫苗之二［J］. 中國家禽，2004，16：43-45.

［5］ Saif Y M. 禽病學［M］. 12版. 蘇敬良，高福，索勛，譯.北京：農(nóng)業(yè)出版社，2011：522.

［6］張康，龔振華，林祥超，等. 對一株超強馬立克氏病毒株的診斷和分析［J］. 中國動物檢疫，2015（4）：14-17.

［7］ Gong Z，Zhang L，Wang J，et al. Isolation and analysis of a very virulent Marek's disease virus strainin China ［J］. Virol J，2013（10）：155.

［8］ 劉秀梵，吳長新. 我國商品肉雞的馬立克氏病及其防制對策［J］. 中國家禽，1996（4）：2-5.

［9］ Mill S H，張昆. 馬立克氏?。壕烤故切露局赀€是老問題［J］. 國外畜牧學，豬與禽，1996（5）：45-46.

［10］ 李增光，薛方明，袁金城. 肉雞馬立克氏病的防治［J］.中國家禽，2007，29：26-28.

［11］ 蔡寶祥. 家畜傳染病學［M］. 4版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［12］ 張訓海， 陳溥言，蔡寶祥. MDV感染雞羽毛根病毒抗原和DNA的動態(tài)檢測［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學學報. 1997，20（4）：75-78.

［13］ 陳志琳，崔治中，秦愛建，等. 表達馬立克氏病病毒gI基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建［J］.揚州大學學報，2002，23（1）：6-8.

（責任編輯：朱迪國）

Cross-sectional Study on Marek's Disease of Broilers in Some Large Intensive Poultry Farms

Guo Guangli1，Zhang Yunxiang2，Wang Liping3，Zhang Kang4，Zhang Li5，Wang Hongwei6，Yu Jianmin6，Li Jinping6，Gong Zhenhua6
（1.Linqu Animal Husbandry Bureau，Linqu，Shandong 262600；2. Vocational Education Center High School of Linqu County，Linqu，Shandong 262600；3. Qingdao Yebio，Co.，Ltd.，Qingdao， Shandong 266109；4.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciencce of CAAS， Lanzhou，Gansu 730050，5.Zhucheng Animal Husbandry and Veterinary Administration Bureau， Zhucheng，Shandong 262600；6.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao， Shandong 266032）

To investigate the epidemiological characteristics of Marek's disease（MD） in broilers， samples of feather pulps and serum were randomly collected respectively from 360 20-day-old broilers and 360 45-day-old broilers，which were derived from 6 un-vaccinated farms. Then the samples were detected for MD by agar gel immunodiffusion test（AGID）and PCR. The AGID results showed that the positive rate of MD was 3.33%～6.67% in 20-day-old broilers and that of the 45-day-old was 5.00%～8.33%；Corresponding results by PCR were 5.00%～10.00% and 8.33%～13.33% respectively. Statistical data showed that the MD positive rates by both tests were 3.33%～5.00% in 20-day-old broilers and 5.00%～6.67% in the 45-day-old broilers. The results indicated that the selected groups were infected with MD in some extent，and more effort should be done to reduce the incidence of MD infection in broilers.

Marek's disease；epidemiological；survey；AGID；PCR

S852.65

A

1005-944X（2016）09-0033-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.010

農(nóng)業(yè)部“2016國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃”（nyf2016-11）

龔振華