吳亞文,王曉亮,張玉玲,王玉梅,李志紅,張學(xué)軍
(寧夏回族自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,寧夏銀川 750011)
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γ-干擾素ELISA檢測方法在牛結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用
吳亞文,王曉亮,張玉玲,王玉梅,李志紅,張學(xué)軍
(寧夏回族自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,寧夏銀川750011)
[目的]了解寧夏賀蘭縣奶牛結(jié)核病的流行情況,為制定寧夏地區(qū)牛結(jié)核病凈化方案提供參考。[方法]2015年采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA檢測方法,對寧夏賀蘭縣2個(gè)規(guī)?;膛鲩_展牛結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查,共檢測奶牛2 230頭。[結(jié)果] 在2個(gè)規(guī)?;膛隼塾?jì)檢測出皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性奶牛79頭,皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA雙陽性奶牛72頭,雙陽性率為3.23%(72/2 230)。[結(jié)論] γ-干擾素ELISA檢測方法準(zhǔn)確度較高;在對牛群進(jìn)行結(jié)核病檢測時(shí),先以皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法篩測,再結(jié)合γ-干擾素ELISA檢測結(jié)果確診,更有利于牛結(jié)核病的檢測與凈化。
牛結(jié)核病;γ-干擾素ELISA;皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng);流行病學(xué)調(diào)查
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種人獸共患慢性傳染病,在全球范圍內(nèi)廣泛流行[1]。結(jié)核分枝桿菌主要有牛型、人型和禽型3種,其中人型和牛型之間可以互相感染,禽型也可以感染牛和人類。牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis)在世界各地均有發(fā)生,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)在《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》中將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病,我國將其列為二類動(dòng)物疫病。牛結(jié)核病作為一種重要的人獸共患病,不僅嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,也是公共衛(wèi)生的重大威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì),10%以上的人結(jié)核病由牛結(jié)核分枝桿菌引起[2]。因此掌握寧夏區(qū)牛結(jié)核病的現(xiàn)狀,檢測、淘汰感染奶牛具有重要意義。
1.1試驗(yàn)動(dòng)物
試驗(yàn)動(dòng)物來自寧夏賀蘭縣A奶牛場1 300頭奶牛、B奶牛場930頭奶牛,合計(jì)2 230頭。 所選牛群均為處于泌乳期的荷斯坦奶牛,年齡2~6歲。
1.2試驗(yàn)器材
電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺、1 mL注射器、5 mL肝素理管、電子剃毛器、超凈工作臺、低溫高速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、微量加樣器、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀(美國伯樂BIO-IAD 680),其余均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室器材。
1.3試劑
國產(chǎn)牛型PPD(結(jié)核菌素純蛋白衍生物、批號201308)購自哈藥集團(tuán)生物有限公司,50頭份/瓶;牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA檢測試劑盒購自青島瑞爾生物有限公司。
2.1PPD單純頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)
單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)參照國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》(GB/T18645—2002)進(jìn)行。采用牛型PPD在奶牛頸部進(jìn)行皮試變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn),劑量為2 000國際單位(IU)/頭,分別于注射前和注射后72 h測量皮膚厚度,計(jì)算皮厚差。結(jié)果判定:局部有明顯的炎性反應(yīng),皮厚差≥4.0 mm為陽性;局部炎性反應(yīng)不明顯,4.0 mm≥皮厚差≥2.0 mm為疑似;無炎性反應(yīng),皮厚差<2.0 mm為陰性。對第一次檢疫結(jié)果為疑似的牛只,60天后進(jìn)行復(fù)檢[3],結(jié)果仍為疑似的,60天后再復(fù)檢,如仍為疑似,則判為陽性。
2.2γ-干擾素ELISA檢測試驗(yàn)
牛尾靜脈采集單純皮內(nèi)PPD變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽性牛全血5 mL,置于肝素理抗凝管中,輕輕顛倒混勻,室溫下送到實(shí)驗(yàn)室檢測。在采血后8 h內(nèi)進(jìn)行刺激培養(yǎng)。將全血無菌分裝24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(1.5 mL/孔,3孔/份樣品),在對應(yīng)的孔內(nèi)無菌加入工作濃度的牛型PPD抗原、禽型PPD抗原、PBS液各100 μL,將各抗原與分裝血液充分混勻后,把含有血液和抗原的細(xì)胞培養(yǎng)板放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育18~24 h。吸取300~400 μL上層血漿,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,即為刺激產(chǎn)生的γ-干擾素上清,-20 ℃貯存待檢(血漿2~8 ℃可保存一周,-20 ℃可保存一個(gè)月)。以牛結(jié)核γ-干擾素ELISA方法,檢測牛全血上清中γ-干擾素,具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1,且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1判為陽性;牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值<0.1或牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值<0.1,則判為陰性。
3.1PPD單純頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果
本次流行病學(xué)調(diào)查共檢出皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性牛79(65+14)頭份,平均陽性檢出率為3.58 %(79/2 230)(表1)。說明寧夏賀蘭縣的2個(gè)規(guī)?;膛龃嬖谂=Y(jié)核病。
表1 賀蘭縣奶牛皮內(nèi)PPD變態(tài)反應(yīng)檢測結(jié)果
3.2γ-干擾素ELISA檢測結(jié)果
對79份單純皮內(nèi)PPD變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽性牛采集全血,用牛型PPD抗原、禽型PPD抗原、PBS液刺激后,收集上清,用牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA檢測試劑盒檢測,發(fā)現(xiàn)平均陽性率為3.23%(72/2 230),檢出陽性率低于皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)。說明皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法可能有部分非特異性反應(yīng)存在,具體結(jié)果見表2。
表2 賀蘭縣奶牛γ-干擾素ELISA檢測結(jié)果
到目前為止,牛結(jié)核病的檢測方法大概可歸為細(xì)菌學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測3類。細(xì)菌學(xué)檢測目前仍被認(rèn)為是結(jié)核病確診的金標(biāo)準(zhǔn)[4],但由于牛分枝桿菌生長緩慢、分離率低,需要較高的生物安全措施,樣品采集需要屠宰活牛,不適用于活畜檢疫,因此嚴(yán)重影響了該方法的推廣。分子生物學(xué)檢測方法發(fā)展最快、特異性好,但靈敏度較差,且要求試驗(yàn)條件較高,不利于普及。牛結(jié)核病的免疫學(xué)檢測方法(血清學(xué)檢測和細(xì)胞免疫檢測),一般認(rèn)為其抗體檢測敏感性較低。因此目前臨床上使用最為廣泛的是細(xì)胞免疫學(xué)診斷方法。細(xì)胞免疫學(xué)診斷方法適用于活畜的診斷,且對試驗(yàn)條件的要求不高,是一種適合推廣的檢測技術(shù)[5]。
單純皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)使用的免疫學(xué)診斷試劑PPD是多種抗原的混合物,其所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌和BCG所共有,因此存在交叉反應(yīng)和非特異性反應(yīng)。若單用該方法對檢出的PPD陽性牛執(zhí)行“檢疫—撲殺”策略,可能會(huì)誤殺假陽性牛。同時(shí)該方法敏感性較低,與感染動(dòng)物接觸的個(gè)體也會(huì)出現(xiàn)假陽性反應(yīng),在疫病早期階段和急性感染期,還會(huì)出現(xiàn)假陰性反應(yīng),可能會(huì)忽略部分感染牛。此外,由于遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響,皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)在30天內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)檢,容易造成病原擴(kuò)散和疫情處置延誤。但其操作簡便、技術(shù)要求簡單、費(fèi)用較低,對大量牛群的普查有一定的積極作用,可為進(jìn)一步檢測確認(rèn)帶來方便,減少檢測的盲目性。因此,在對牛群進(jìn)行結(jié)核病檢測時(shí),應(yīng)先進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)檢測,檢測結(jié)果陽性的牛先隔離,然后結(jié)合γ-干擾素ELISA方法檢測的結(jié)果來綜合判斷。只有兩者檢測均為陽性的牛,才予以淘汰。
采用單純皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA試驗(yàn)對寧夏賀蘭牛結(jié)核病進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核病在2個(gè)規(guī)?;膛鲋芯写嬖?;通過對比皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA方法檢測的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)γ-干擾素ELISA檢測方法的準(zhǔn)確度高,可作為輔助手段用于結(jié)核病的檢測及凈化。兩者結(jié)合,既可以避免部分錯(cuò)篩帶來的經(jīng)濟(jì)損失,又可以避免因漏檢感染牛而導(dǎo)致的疫情擴(kuò)散。只有通過該方法對牛群進(jìn)行檢測,確定并淘汰陽性牛,才能最終達(dá)到牛結(jié)核病的凈化目的[6]。
[1]韓猛,張亮,王基隆,等. 山東省規(guī)模化奶牛場結(jié)核病與副結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,14:10-13.
[2]陳祥,徐正中,時(shí)振華,等. γ-干擾素試驗(yàn)和皮試變態(tài)反應(yīng)對檢測奶牛結(jié)核病的比較[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào),2011(2):97-100.
[3]周培校,李靜,張魯安,等. 牛結(jié)核γ—干擾素ELISA檢測方法在檢疫工作中的應(yīng)用[J]. 中國動(dòng)物檢疫,2014(1):67-71.
[4]張喜悅,呼西旦,楊經(jīng)緯,等. γ-干擾素試驗(yàn)及比較皮試在結(jié)核污染牛群的應(yīng)用研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào),2010(1):53-56.
[5]王楠,王作友,江希玲,等. 四種不同檢測方法在奶牛結(jié)核病診斷中應(yīng)用的比較研究[J]. 吉林畜牧獸醫(yī),2012(11):19-20.
[6]徐賢坤,熊毅,韋達(dá)有,等. γ-干擾素ELISA檢測方法在廣西牛結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013(4):667-670.
(責(zé)任編輯:朱迪國)
Applications of IFN-γ ELISA for Epidemiological Survey of Bovine Tuberculosis
Wu Yawen,Wang Xiaoliang,Zhang Yuling,Wang Yumei,Li Zhihong,Zhang xuejun
(Ningxia Animal Disease Prevention and Control Center,Yinchuan,Ningxia 750011)
[Objective] In order to investigate the prevalence status of bovine tuberculosis in Helan county and to provide a reference for purifi cation and comprehensive prevention and control of bovine tuberculosis in Ningxia. [Methods]Using the tuberculin skin test(TST)and IFN-γ ELISA,2 230 cows from 2 large-scale dairy farms were detected.[Results] 79 positive cows from 2 dairy farms were detected by TST,72 of them were still positive results tested by IFN-γ ELISA subsequently,the double positive rate by both methods was 3.23%(72/2 230). [Conclusion] The results showed that the accuracy of bovine tuberculosis IFN-γ ELISA was relatively higher. TST conjunction with IFN-γ ELISA could be more conducive to bovine tuberculosis detection and purifi cation.
bovine tuberculosis;INF-γ ELISA;tubulin skin test;epidemiological survey
S851.3
B
1005-944X(2016)09-0078-03
10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.024
寧夏回族自治區(qū)科技支撐項(xiàng)目(2013ZZN30)