鐘召兵，王 寧，楊夫會

（泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安　271000）

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畜禽舍空氣細(xì)菌內(nèi)毒素兩種檢測方法的比較研究

鐘召兵，王 寧，楊夫會

（泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安271000）

［目的］比較氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MSMS）與鱟試驗（LAL）在檢測畜禽舍空氣內(nèi)毒素中的應(yīng)用效果及相關(guān)性，以及氣載內(nèi)毒素是否對環(huán)境和飼養(yǎng)人員健康構(gòu)成危害。［方法］通過國際標(biāo)準(zhǔn)AGI-30液體沖擊式空氣采樣器，在4個養(yǎng)殖場16個畜禽舍采集空氣樣品，采用GC-MSMS與LAL測定空氣細(xì)菌內(nèi)毒素濃度。［結(jié)果］LAL測定的牛舍、豬舍、羊舍和禽舍空氣細(xì)菌內(nèi)毒素濃度中間值分別為1.85×105EU/m3、2.76×106EU/ m3、4.82×105EU/m3、6.55×106EU/m3；而GC-MSMS測定的分別為3.3×104EU/m3、1.26×105EU/m3、2.4×104EU/m3和8.21×105EU/m3。GC-MSMS在禽舍檢測出的空氣內(nèi)毒素濃度顯著大于其他畜舍（p＜0.05）。用LAL和GC-MSMS分析測定的空氣中內(nèi)毒素濃度超過了對大多數(shù)動物和人體有威脅的閾限值1.0×103EU/m3。用GCMSMS與LAL測定的禽舍和羊舍空氣樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素濃度之間存在顯著相關(guān)（p＜0.05），而牛舍和豬舍之間濃度沒有顯著相關(guān)性。GC-MSMS主要檢測存在于動物舍空氣內(nèi)毒素中含有C14-C18鏈的3-羥基脂肪酸。LAL測定的內(nèi)毒素濃度與含有C14-C16鏈3-羥基脂肪酸量之間有顯著相關(guān)（p＜0.05）。［結(jié)論］ GC-MSMS與LAL聯(lián)合應(yīng)用可以提高檢測氣載內(nèi)毒素的準(zhǔn)確性，且本研究表明畜禽舍中檢測到的空氣細(xì)菌內(nèi)毒素濃度可以危害人類和家畜動物健康。

畜禽舍；氣載細(xì)菌內(nèi)毒素；鱟 試驗；氣相色譜-質(zhì)譜；3-羥基脂肪酸

動物養(yǎng)殖場空氣中含有大量微生物，包括真菌、病毒、塵螨、孢子、細(xì)菌及產(chǎn)物。其中細(xì)菌內(nèi)毒素可對動物及人體產(chǎn)生極大的危害，可引起人體發(fā)熱甚至休克。氣載內(nèi)毒素已經(jīng)被確定為導(dǎo)致人類和動物呼吸道疾病的重要因素［1］。內(nèi)毒素可引起組胺、5-羥色胺、前列腺素、激肽等的釋放，導(dǎo)致急性炎癥，破壞在肺部進行氣體交換自由基的釋放，在肺部引起炎癥反應(yīng)及嚴(yán)重的支氣管痙攣。

內(nèi)毒素通常用鱟試驗（LAL）檢測。當(dāng)極微量內(nèi)毒素與鱟變形細(xì)胞凍融后的溶解物（鱟試劑）接觸時，可激活凝固酶原，繼而使可溶性凝固蛋白原變成凝固蛋白而使鱟變形細(xì)胞凍融物呈凝膠狀態(tài)。這種技術(shù)被認(rèn)為是檢測細(xì)菌內(nèi)毒素生物活性的有效方法，但具有非特異性。細(xì)菌內(nèi)毒素的毒性及生物活性中心類脂A的長鏈脂肪酸部分經(jīng)水解形成相應(yīng)的3-羥基脂肪酸，經(jīng)衍生化后可通過氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GS-MSMS）進行檢測，與LAL試驗相比，其細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度結(jié)果更精確，且不受非特異影響。

目前，空氣中內(nèi)毒素含量在多少之內(nèi)不會影響動物和人類健康等問題還在研究中。Donham等［2］研究提出，環(huán)境中氣載內(nèi)毒素對人體產(chǎn)生威脅的濃度是1.5×104EU/m3。而據(jù)大量的研究，環(huán)境中氣載內(nèi)毒素的濃度對人體和動物無影響的推薦標(biāo)準(zhǔn)為1.0×103EU/m3。

本研究采用LAL和GC-MSMS對畜禽養(yǎng)殖場環(huán)境空氣中氣載細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度進行檢測和分析，比較兩種方法之間的相關(guān)性以及效用，了解動物養(yǎng)殖舍氣載細(xì)菌內(nèi)毒素的現(xiàn)狀及對飼養(yǎng)人員和畜禽潛在的健康威脅，為有效控制畜禽疾病的流行提供科學(xué)依據(jù)和預(yù)警資料。

1　材料與方法

1.1動物養(yǎng)殖舍情況

本試驗在4個畜禽養(yǎng)殖場16個畜禽舍內(nèi)進行，各個養(yǎng)殖場的具體情況見表1。

表1　被研究的畜禽養(yǎng)殖場情況

1.2環(huán)境空氣細(xì)菌內(nèi)毒素樣品采集

利用國際標(biāo)準(zhǔn)AGI-30液體沖擊式空氣采樣器采集樣品（All Glass Impinger AGI-30），通過鱟變形細(xì)胞溶解物試驗（Limulus Amebocyte Lysate Test）檢測。將收集器置于舍中央，放置高度為80 cm，以50 mL內(nèi)毒素檢查用水（湛江海洋生物制品廠）為采樣介質(zhì)，采樣時氣流速度為12.5 L/min，驅(qū)動時間為30 min。在每一個采樣點收集兩個樣本，一個用于LAL試驗，另一個用于GC-MSMS分析。所有樣本存儲在-15 ℃。

1.3LAL試驗

提取樣品液100 mL，在室溫條件下離心1 h，并加熱到100 ℃ 15 min （溶解內(nèi)毒素和干擾物質(zhì)失活），冷卻后，按照《中國藥典2010版》附錄XIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法測定樣品中氣載內(nèi)毒素濃度［3］。

1.4GC-MSMS試驗

將100 mL樣品液經(jīng)過2次正己烷萃取后，在洗脫液中加入1.0 g在400 ℃馬弗爐內(nèi)4 h后冷卻的無水硫酸鈉，除去水分，轉(zhuǎn)移試管后用微弱氮氣緩慢吹干，加入0.4 mL丙酮及0.05 mL BSTFA衍生化試劑，劇烈震蕩0.5 min，室溫下衍生化30 min，使反應(yīng)完全。最后加入0.01 mL內(nèi)標(biāo)液，定容至0.5 mL，備GC-MSMS定量分析。

色譜條件：色譜柱為DB-5（60 m×0.25 mm i.d.）；載氣為氦氣，恒壓，柱前壓206 kPa；進樣口溫度為250 ℃；柱溫：初始溫度為90 ℃，在此溫度下保持5 min，然后以5℃ /min的升溫速率升至280 ℃，在此溫度下保持5 min，進樣量為1 μL，不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI）；離子源溫度為250 ℃；接口溫度為280 ℃；質(zhì)譜掃描范圍：m/z 13～449。溶劑延遲時間為10 min.

1.5統(tǒng)計分析

因為空氣中微生物數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，為了減少數(shù)據(jù)誤差，達到比較準(zhǔn)確反應(yīng)真值的目的，將畜禽舍環(huán)境氣載內(nèi)毒素濃度采用中間值（Median）表示［4］。此外，用Mann-Whitney檢驗確定特定環(huán)境之間的差異，使用Windows 5.0package（StatSoft STATISTIC，美國）對兩種方法進行相關(guān)性分析。

2　結(jié)果

2.1鱟試驗測定的環(huán)境氣載內(nèi)毒素濃度

雞舍內(nèi)毒素濃度最大，為5.2×104～1.06×107EU/m3（中 間 值：6.55×106EU/m3）； 羊 舍 為2.62×105～2.144×106EU/m3（中間值：4.82×105EU/m3）；豬舍為1.9×104～1.32×107EU/m3（中間值：2.76×106EU/m3）；牛舍內(nèi)毒素濃度的中位數(shù)最小，為1.73×104～3.83×105EU/m3（中間值：1.85×105EU/m3）（表2）。

鱟試驗的結(jié)果表明，其隨機分布特征變化較大，但是封閉式禽舍與牛羊舍的內(nèi)毒素濃度之間有顯著差異（P＜0.05）。

2.2氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定的氣載內(nèi)毒素濃度

空氣中內(nèi)毒素濃度最大是雞場，為2.83×105～1.10×106EU/m3（ 中 間 值：8.21×105EU/m3）。此濃度與牛場、豬場和羊場的濃度有顯著差異（P ＜0.05）（表2）。牛場氣載毒素的濃度為3.8×103～1.41×105EU/m3（中間值：3.3×104EU/m3），豬場為2.3×104～2.37×105EU/m3（中間值：1.26×105EU/m3）。氣載內(nèi)毒素濃度最小的為羊場，為6.7×103～2.87×104EU/m3（中間值：2.4×104EU/m3）（表2）。

2.3GC-MSMS采用3-羥基脂肪酸（C10-C18）特異性測定的內(nèi)毒素濃度

革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素所含的長鏈脂肪酸經(jīng)水解形成相應(yīng)的3-羥基脂肪酸，利用其共同特征10-18碳鏈對3-羥基脂肪酸進行分析，這為GCMSMS提供了檢測革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的基礎(chǔ)?？傊谛笄輬隹諝庵屑?xì)菌內(nèi)毒素類脂A的長鏈脂肪酸水解產(chǎn)生14-18碳鏈?zhǔn)瞧涔餐卣?。在羊場和雞場，3-OH-C16和3-OH-C18占大部分；而在豬場、牛場，3-OH-C14和3-OH-C16占優(yōu)勢。而短碳鏈（10-12C）脂肪酸極少，在此環(huán)境下不會被檢測到（表2）。

2.4LAL與GC-MSMS的結(jié)果對比

在禽場和羊場的空氣樣本中，LAL試驗測定的具有生物活性的內(nèi)毒素濃度與GC-MSMS測定的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度之間存在顯著相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)分別為R =1.0且r = 0.95，P ＜0.05），在牛場和豬場采集的空氣樣品中，具有生物活性的內(nèi)毒素濃度與GC-MSMS測定細(xì)菌內(nèi)毒素濃度之間無顯著相關(guān)。在所有空氣樣品中，LAL試驗測定的生物活性內(nèi)毒素濃度與GC-MSMS測定的3-羥基脂肪酸總量與3-OH-C14、3-OH-C16和3-OH-C16-18之間存在顯著相關(guān)性（P ＜0.05）（表3）。

對采集的所有空氣樣本，LAL試驗測定的生物學(xué)活性內(nèi)毒素總濃度和3-OH-C14、3-OH-C16、3-OH-C16-18的納摩爾總和與GC-MSMS測定的3-羥基脂肪酸總和之間沒有顯著相關(guān)性（P ＜0.05）（表3）。LAL測定的空氣細(xì)菌內(nèi)毒素總濃度與GC-MSMS測定的空氣中內(nèi)毒素總濃度之間的沒有顯著相關(guān)性（P＞0.2）。

3　討論

在四種畜禽場中，養(yǎng)殖場工人和舍內(nèi)動物吸入氣載細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生潛在的健康風(fēng)險最大。LAL法和GC-MSMS法測定的畜禽舍空氣中內(nèi)毒素濃度超過了對人和大多數(shù)動物無影響的推薦標(biāo)準(zhǔn)1.0×103EU/m3。在16個樣品中11個通過LAL（68.8%）和16個樣品中10個通過GC-MSMS（62.5%）測定的氣載毒素在1.0×105～1.02×105EU/m3之間，有對工人和動物造成呼吸系統(tǒng)疾病的潛在威脅。

本次研究的氣載內(nèi)毒素濃度比此前研究報道的要高，應(yīng)是所采用的方法和檢測環(huán)境條件存在差異導(dǎo)致的。由LAL或GC-MSMS法測定的牛舍氣載內(nèi)毒素濃度比來自德國Berger等［5］報道的1.55×106EU/m3要小，比波蘭Dutkiewicz等［6］報道的1.0×104EU/m3要高。在養(yǎng)豬場，由LAL測定的空氣中內(nèi)毒素濃度比韓國Chang等［7］和美國Donham等［8］分別報道的2.98×102EU/m3、8×105EU/m3要高，類似于加拿大Zejda等［9］報道的1.35×106EU/m3，但比波蘭Mackiewicz等［10］報道的12.46×106EU/m3要小。在養(yǎng)豬場通過GC-MSMS測定的空氣內(nèi)毒素濃度比來自韓國Chang 等［7］報道的3.68×101EU/m3要高，比英國Simpson 等［11］報道的7.2×105EU/m3要小。在禽舍由LAL測定的空氣中內(nèi)毒素濃度比美國Donham等［8］報道的6.14×102EU/m3要高。在禽舍用GC-MSMS測定的空氣中毒素濃度比美國Donham等［8］報道的1.0×102EU/m3要高，比英國Simpson 等［11］報道的1.03×106EU/m3要小。

表2　LAL和GC-MSMS檢測畜禽養(yǎng)殖場空氣內(nèi)毒素濃度

表3　GC-MSMS檢測內(nèi)毒素和LAL檢測具有生物活性內(nèi)毒素與3-羥基脂肪酸濃度之間的相關(guān)性

關(guān)于羊場氣載內(nèi)毒素，至今很少有研究報道。本研究表明綿羊舍空氣中內(nèi)毒素濃度非常高，通過LAL法檢測的氣載內(nèi)毒素濃度超過了對人和大多數(shù)動物無影響推薦標(biāo)準(zhǔn)，對飼養(yǎng)人員存在引起呼吸道疾病的潛在威脅。

LAL與GC-MSMS方法在羊棚和禽舍測定的氣載內(nèi)毒素濃度存在顯著相關(guān)性，其他動物舍的濃度之間沒有相關(guān)性。在本研究中LAL測定的內(nèi)毒素濃度通常高于GC-MSMS法。這不符合早期報道的研究結(jié)果，可能是由于影響兩種方法非特異性的LAL反應(yīng)的存在。在本研究中，GC-MSMS法比LAL法測定的結(jié)果更精確，因此GC-MSMS法可以作為內(nèi)毒素測定的可靠方法。

用GC-MSMS法可檢測舍空氣內(nèi)毒素中含有14-18碳鏈（3-OH-C14-18）的3-羥基脂肪酸。3-OH-C14是腸桿菌科革蘭氏陰性菌產(chǎn)生內(nèi)毒素的特征之一。應(yīng)注意的是，在本研究中，LAL試驗測定得生物學(xué)活性內(nèi)毒素的濃度與GC-MSMS分析測定的3-OH-C14和3-OH-C16總量之間存在顯著相關(guān)性。這表明含有14-16碳鏈3-羥基脂肪酸特征的內(nèi)毒素會對舍內(nèi)畜禽和飼養(yǎng)工人產(chǎn)生危害。而3-OH-C18沒有特異性，因為在一些革蘭氏陽性菌如放線菌中也可檢測到。

［1］ Schierl R，Heise A，Egger U，et al. Endotoxin concentrations in modern animal houses in southern Bavaria［J］. Ann Agric Environ Med，2007，14：129-136.

［2］ Donham K J，Haglind P，Peterson Y，et al. Environmental and health studies of farm workers in Swedish swine confi nement buildings［J］. Brit J Ind Med，1989，46：31-37.

［3］ 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典：二部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99-102.

［4］ 金丕煥.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計方法［M］ .上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1992：20-21.

［5］ Berger I，Schierl R，Ochmann U，et al. Concentrations of dust，allergens and endotoxin in stables，living rooms and mattresses from cattle farmers in southern Bavaria［J］. Ann Agric Envi- ron Med，2005，12：101-107.

［6］ Dutkiewicz J，Pomorski Z J H，Sitkowska J，et al. Airborne microorgan- isms and endotoxin in animal houses［J］. Grana，1994，33：85-90.

［7］ Chang C W，Chung H，Huang CF，et al. Exposure assessment to airborne endotoxin，dust，ammonia，hydrogen sulfide and carbon dioxide in open style swine houses［J］. Ann Occup Hyg，2001，45：457-465.

［8］ Donham K J，Cumro D，Reynolds S J，et al. Doseresponse relationships between occupational aerosols exposures and cross-shift de-clines of lung function in poultry workers. Recommendations for expo- sure limits［J］. J Occup Med，2000，42：260-269.

［9］ Zejda J E，Barber E，Dosman J A，et al. Respiratory health status in swine producers relates to endotoxin exposure in the presence of low dust levels［J］. J Occup Environ Med，1994，36：49-56.

［10］ Mackiewicz B. Study on exposure of pig farm workers to bioaero- sols，immunologic reactivity and health effects［J］. Ann Agric Environ Med，1998，5：169-175.

［11］ Simpson J C，Niven R M，Pickering C A，et al. Comparative personal exposures to organic dusts and endotoxin［J］. Ann Occup Hyg，1999，43：107-115.

（責(zé)任編輯：杜憲）

Comparison of Two Detection Methods for Airborne Bacterial Endotoxin in Livestock and Poultry Houses

Zhong Zhaobing，Wang Ning，Yang Fuhui
（Daiyue Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Taian，Shandong 271018）

［Objective］ To compare the application effect and correlation of the gas chromatography-tandem mass spectrometry method（GC-MSMS）and the Limulus test（LAL）in testing the airborne endotoxin，and to analyze whether airborne endotoxin is harmful to the environment and breeders health. ［Methods］ Air samples were collected by using the international standard AGI-30 air samplers of liquid impingement in 16 livestock and poultry houses from 4 farms，and examined for the concentration of bacterial endotoxin with the LAL test and GC-MSMS technique. ［Results］The median concentrations of airborne endotoxin determined by LAL test in cow barns，piggeries，sheep sheds and poultry houses were 1.85×105EU/m3，2.76×106EU/m3，4.82×105EU/m3，6.55×106EU/m3respectively，while those measured by the GC-MSMS technique were respectively 3.3×104EU/m3，1.26×105EU/m3，2.4×104EU/m3and 8.21×105EU/m3. The concentrations of airborne endotoxin detected by GC-MSMS method in poultry houses were signifi cantly higher than any other examined barns（p＜0.05）. The concentrations of airborne endotoxin determined with LAL test and GC-MSMS analysis surpassed the threshold（1.0×103EU/m3）above which would be harmful to most animals and humans. A signifi cant correlation（p＜0.05）between the concentrations of endotoxin determined bythe LAL and GC-MSMS techniques was found in the air samples from poultry houses and sheep sheds，but not found in other examined barns. GC-MSMS method was designed to detected 3-hydroxy fatty acids containing C14-C18chains of airborne bacterial endotoxin in livestock and poultry houses. A signifi cant correlation（p＜0.05）was found between the concentrations of endotoxin determined with LAL test and the amounts of 3-hydroxy fatty acids with C14-C16chains.［Conclusion］ The combination of GC-MSMS technique and LAL test will improve the accuracy of measurement. The endotoxin concentration detected in this study could be a respiratory hazard to both humans and livestock animals.

livestock and poultry houses；airborne bacterial endotoxin；Limulus test；gas chromatography-tandem mass spectrometry；3-hydroxy fatty acids

S851.2+4

B

1005-944X（2016）09-0088-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.027

國家自然科學(xué)基金——動物舍微生物氣溶膠傳播模式研究（30571381）