孫悅鑫 周映包軍

210008南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院皮膚性病科

·論著·

JAK2/STAT3信號通路選擇性抑制劑AG490對人瘢痕疙瘩成纖維細胞的生物行為學影響及可能機制

孫悅鑫 周映包軍

210008南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院皮膚性病科

目的觀察JAK2/STAT3信號通路選擇性抑制劑AG490對人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKF）生物行為學的影響及可能機制。方法將體外培養(yǎng)的人正常真皮成纖維細胞（HSF）、HKF分別用濃度為12.5、25、50、75、100μmol/LAG490處理為實驗組，以不加AG490組為陰性對照組。CCK?8檢測各實驗組和陰性對照組HSF和HKF培養(yǎng)24、48、72 h后的細胞增殖抑制率；流式細胞儀檢測各組HKF培養(yǎng)24 h后的細胞周期分布及細胞凋亡；RT?PCR檢測各組HKF培養(yǎng)24 h后，STAT3、細胞周期蛋白D1mRNA的表達情況，同時檢測不予任何藥物處理的HSF、HKF中STAT3mRNA表達；Western印跡法檢測各組HSF、HKF培養(yǎng)24 h后STAT3、p?STAT3蛋白表達情況。結果CCK?8法顯示，隨AG490藥物濃度的增加和作用時間的延長，AG490對HSF、HKF增殖的抑制率增加，且該抑制作用呈濃度和時間依賴性（均P＜0.05）。在相同濃度AG490作用相同時間的情況下，HKF增殖抑制率大于HSF（P＜0.05）。流式細胞儀顯示，隨AG490藥物濃度的增加，HKFG1期細胞比例逐漸增加（P＜0.01），G2期細胞比例逐漸減少（P＜0.01），S期細胞無明顯變化（P＞0.05），細胞凋亡率逐漸增加（P＜0.01）。RT?PCR顯示，在不予任何加藥處理的情況下，體外正常培養(yǎng)HSF、HKF 24 h后，HKF組STAT3mRNA相對表達量顯著高于HSF組（P＜0.05）。AG490作用HKF 24 h后，STAT3、細胞周期蛋白D1mRNA相對表達量隨AG490濃度的增加而逐漸降低。相關分析顯示，經(jīng)AG490處理的HKF細胞中細胞周期蛋白D1mRNA的表達量與STAT3mRNA的表達量呈正相關（r=0.855，P＜0.01）。Western印跡顯示，隨AG490藥物濃度的增加，HSF、HKF中STAT3、p?STAT3的表達均逐漸降低（P＜0.05），且HKF中STAT3、p?STAT3蛋白表達量低于HSF（P＜0.05）。結論AG490可通過選擇性阻斷JAK2/STAT3信號通路，有效抑制人瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖。

瘢痕疙瘩；成纖維細胞；細胞周期蛋白D1；STAT3轉(zhuǎn)錄因子；AG490

越來越多的研究表明，阻斷STAT3的激活可以明顯抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，但對正常細胞的生理功能影響較?。?］。研究發(fā)現(xiàn)［2］，人瘢痕疙瘩成纖維細胞（human keloid?derived fibroblasts，HKF）中STAT3呈過量表達并伴有第705位的酪氨酸磷酸化，并證明了STAT3在瘢痕疙瘩發(fā)病機制中的重要作用。酪氨酸磷酸化抑制劑AG490的結構類似酪氨酸，可以與受體酪氨酸激酶競爭結合位點，是JAK2激酶抑制劑，其毒副作用小，安全性高，可選擇性阻斷STAT3信號通路［3］。大量研究表明［4?6］，AG490可以在一定程度上抑制STAT3的表達。我們以人正常成纖維細胞（human skin fibroblasts，HSF）作為HKF的對照，探討JAK2/STAT3信號通路的選擇性抑制劑AG490對HKF生物行為的影響及可能機制。

材料與方法

一、材料

HKF細胞株購于美國標準生物品收藏中心（ATCC）細胞庫，HSF細胞株購于江蘇凱基生物技術股份有限公司。AG490（美國MedChem Express公司），二甲亞砜（DMSO）、1%抗生素溶液（美國Sigma公司），胎牛血清、胰酶、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），碘化丙啶（PI）細胞周期檢測試劑盒（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司），膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）?異硫氰酸熒光素（FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司），SYBRGreen實時熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］，STAT3抗體、磷酸化STAT3（p?STAT3）（Tyr705）抗體（英國abcam公司）。

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng)及實驗分組：采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將HSF、HKF按1×105/m l接種于25ml或50ml細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將藥物AG490溶解于DMSO，以DMEM培養(yǎng)基配置該藥物，AG490終濃度分別為12.5、25、50、75、100μmol/L，分別加入HSF或HKF中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，此為各濃度實驗組。以不加AG490、只加含DMSO的DMEM培養(yǎng)基孵育HSF或HKF為陰性對照組。DMSO在培養(yǎng)基中的最大終濃度＜0.2%，經(jīng)預實驗證實對細胞增殖無影響。

2.CCK?8檢測細胞增殖：取對數(shù)生長期HSF、HKF，按5×104/ml接種于96孔板，每孔100μl，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。去上清液，實驗組細胞每孔加入含12.5、25、50、75、100μmol/L AG490的DMEM培養(yǎng)基100μl，每一濃度設3個復孔；陰性對照組細胞加入含DMSO的DMEM培養(yǎng)基100μl；空白對照組只加不含細胞的DMEM培養(yǎng)基100μl。將96孔板置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72 h后，用DMEM培養(yǎng)基小心洗滌細胞1次。每孔加入DMEM培養(yǎng)基100μl后再加入10μlCCK?8溶液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標儀450 nm波長下測量各孔吸光度值，細胞增殖抑制率=［1-（實驗組平均吸光度-空白組平均吸光度）/（對照組平均吸光度-空白組平均吸光度）］×100%。

3.流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡：取對數(shù)生長期HKF，按1×106/ml接種于6孔板，加入不含胎牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。去上清液，每孔加入含0、12.5、25、50、75、100μmol/L AG490的DMEM培養(yǎng)基2m l，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min（離心半徑12 cm）離心5min，收集細胞用于以下檢測：①細胞周期：用4℃磷酸鹽緩沖液（PBS）1m l重懸細胞，再次離心，PBS重復上述步驟洗滌2次，70%冰乙醇過夜。再次離心，棄上清液，PBS洗2次，移至流式管中，加100μl核糖核酸酶A（RNaseA）37℃水浴30min；再加入400μl PI室溫避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期；②Annexin V?FITC染色檢測細胞凋亡：收集細胞制成單細胞懸液，用500μl PBS重懸，加入5μl Annexin V?FITC混勻后，加入PI5μl，室溫避光染色15min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

4.Western印跡法檢測STAT3、p?STAT3蛋白水平：將HSF、HKF分別與含0、12.5、25、50、75、100μmol/LAG490的DMEM培養(yǎng)基作用24 h后，提出相同質(zhì)量的蛋白，凝膠電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，加一抗（STAT3抗體或p?STAT3抗體）4℃孵育過夜后，加二抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光法檢測反應條帶。對圖像進行分析，應用BandScan 4.5圖像分析軟件，以β肌動蛋白的表達灰度值為內(nèi)參照，計算STAT3、p?STAT3的相對表達水平。

5.RT?PCR檢測STAT3、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）mRNA的表達：檢索基因庫，應用Primer 5.0軟件設計上、下游引物，STAT3上游引物5′?CACATGCCACTTTGGTGTTTCA?3′，下游引物5′?GGGCAATCTCCATTGGCTTC?3′，擴增產(chǎn)物156 bp；Cyclin D1上游引物5′?TCGGTGTCCTACTTCAAATG TGT?3′，下游引物5′?GAAGCGGTCCAGGTAGTTCA?3′，擴增產(chǎn)物144 bp；β肌動蛋白上游引物5′?TGGCA CCCAGCACAATGAA?3′，下游引物5′?CTAAGTCAT AGTCCGCCTAGAAGCA?3′，擴增產(chǎn)物186 bp，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

用含0、12.5、25、50、75、100μmol/L AG490的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HKF 24 h。收集各組細胞，提取總RNA，將提取的總RNA按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取cDNA 1μl，加2×SYBR Green Mix 10μl，上下游引物各1μl，加DEPC水至反應總體積20μl進行定量PCR反應。反應條件：95℃預變性5min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，反應40個循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸5 min。反應結束后，在ABIPrism SDS 2.0軟件上自動分析，查看每個基因的擴增情況，導出相應的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。以2?ΔΔCt計算STAT3、Cyclin D1 mRNA的相對表達量，ΔΔCt=（實驗組目的基因Ct-實驗組內(nèi)參基因Ct）-（對照組目的基因Ct-對照組內(nèi)參基因Ct）。此外，在不予任何加藥處理的情況下體外培養(yǎng)HSF及HKF 24 h，以HSF為對照組，按上述步驟進行實驗，采用2-ΔΔCt計算STAT3mRNA相對表達量。

三、統(tǒng)計學處理

結果

一、AG490對HSF、HKF增殖的抑制作用

如圖1所示，隨AG490濃度的增加和作用時間的延長，AG490對HSF、HKF增殖的抑制率增加。經(jīng)雙因素方差分析，AG490對HSF、HKF增殖的抑制呈濃度（HSF：F濃度=293.123；HKF：F濃度=136.302；均P＜0.05）和時間依賴性（HSF：F時間=22.829；HKF：F時間=25.749；均P＜0.05），且藥物濃度與時間有交互作用（FHSF=2.473，F(xiàn)HKF=3.049，均P＜0.05）。兩兩多重比較顯示，12.5、25、50、75、100μmol/L AG490作用24、48、72 h后，HSF、HKF增殖抑制率均顯著高于各自的陰性對照組（0.00±0.00），差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；在相同濃度AG490作用相同時間的情況下，HKF增殖抑制率大于HSF，且100μmol/L AG490作用HKF細胞72 h時對其增殖的抑制率最高。

圖1不同濃度AG490作用24、48、72 h對人正常成纖維細胞（HSF）、人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKF）增殖的抑制隨AG490濃度增加和作用時間延長，AG490對HSF、HKF增殖的抑制率增加；在相同濃度AG490作用相同時間的情況下，HKF增殖抑制率大于HSF，且100μmol/LAG490作用HKF細胞72 h時對其增殖的抑制率最高

二、AG490對HKF細胞周期及凋亡的影響

不同濃度AG490作用HKF 24 h對其細胞周期及凋亡的影響見表1。單因素方差分析顯示，隨著AG490濃度的增加，G1期細胞比例逐漸增加（P＜0.01），G2期細胞比例逐漸減少（P＜0.01），S期細胞無明顯變化（P＞0.05），細胞凋亡率逐漸增加（P＜0.01）。當AG490濃度超過50μmol/L時，實驗組G1期細胞比例、細胞凋亡率與陰性對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 不同濃度AG490作用人瘢痕疙瘩成纖維細胞24 h對其細胞周期、凋亡的影響（±s）

表1 不同濃度AG490作用人瘢痕疙瘩成纖維細胞24 h對其細胞周期、凋亡的影響（±s）

注：n=3。a：不同濃度藥物組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；b：與上一濃度組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）

組別陰性對照組12.5μmol/LAG490組25μmol/LAG490組50μmol/LAG490組75μmol/LAG490組100μmol/LAG490組F值P值細胞周期（%）G1期20.45±0.34 22.73±2.23 25.12±1.63 32.09±8.38a 37.75±4.22a 43.19±1.69a 15.056＜0.01 S期27.28±1.56 28.18±4.12 32.80±4.10 36.54±3.05 30.52±1.84 32.18±4.69 2.894＞0.05 G2期51.14±3.28 49.80±2.97 43.52±4.38ab 34.56±3.01ab 33.49±1.50a 24.63±4.89ab 26.270＜0.01細胞凋亡率（%）2.67±0.74 4.09±0.30 6.44±0.46 8.99±1.25a 19.40±4.68ab 47.81±6.14ab 85.692＜0.01

三、AG490對HKF中STAT3、Cyclin D1mRNA表達的影響

在不予任何加藥處理的情況下，體外正常培養(yǎng)HSF、HKF 24 h。HKF組STAT3mRNA相對表達量（2.1883±0.2747）顯著高于HSF組（1.0281±0.2521），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.401，P＜0.05）。

0、12.5、25、50、75、100μmol/L AG490作用HKF 24 h后，HKF中STAT3、Cyclin D1mRNA相對表達量隨AG490濃度的增加而逐漸降低，見表2。兩兩多重比較顯示，除12.5μmol/L AG490組STAT3的相對表達量以外，其余各實驗組STAT3、Cyclin D1mRNA相對表達量均顯著低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。相關分析顯示，Cyclin D1mRNA的表達量與STAT3mRNA的表達量呈正相關（r=0.855，P＜0.01）。

四、AG490對HSF、HKF中STAT3、p?STAT3蛋白表達的影響

如圖2所示，隨AG490藥物濃度的增加，HSF、HKF中STAT3、p?STAT3的表達均逐漸降低，且HKF中STAT3、p?STAT3蛋白表達量低于HSF。雙因素方差分析顯示，HSF與HKF組間STAT3、p?STAT3蛋白表達量不同（FSTAT3=81.056，F(xiàn)p?STAT3=89.734；均P＜0.05），0～100μmol/L AG490組間STAT3、p?STAT3蛋白表達量亦不同（FSTAT3=46.082，F(xiàn)p?STAT3=130.105；均P＜0.05）。兩兩多重比較顯示，不同濃度AG490組STAT3、p?STAT3蛋白表達量均低于相應的陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

討論

JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路在細胞因子信號傳遞

圖2不同濃度AG490對人正常成纖維細胞（HSF）、人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKF）STAT3、pSTAT3蛋白表達的影響隨AG490濃度增加，HSF、HKF中STAT3、p?STAT3的表達均逐漸降低，且HKF中STAT3、p?STAT3蛋白表達量低于HSF中發(fā)揮主導作用，參與細胞因子對細胞的生長、分化及功能的調(diào)節(jié)。STAT3為JAK/STAT信號通路中的一種關鍵因子，也是腫瘤發(fā)病機制中的一個關鍵調(diào)控者［7］。研究表明［2］，STAT3在瘢痕疙瘩組織以及體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞中均呈高表達，在瘢痕疙瘩的發(fā)病機制中起重要作用，而STAT3的抑制劑可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的活性。STAT3的下游靶基因都與細胞增殖、凋亡密切相關，如B淋巴細胞瘤?2（Bcl?2）、Cyclin D1、原癌基因（c?Myc）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等［8］，異?；罨腟TAT3可誘導這些下游靶基因異常表達，促進瘢痕疙瘩的生長。因此，STAT3可作為瘢痕疙瘩的一個治療靶點。在本研究中我們選用AG490作為STAT3信號通路抑制劑，研究其對HKF生物行為學的影響及可能機制。

表2 不同濃度AG490作用人正常成纖維細胞（HSF）、人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKF）24 h后STAT3、pSTAT3蛋白以及STAT3、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）mRNA相對表達量（±s）

表2 不同濃度AG490作用人正常成纖維細胞（HSF）、人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKF）24 h后STAT3、pSTAT3蛋白以及STAT3、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）mRNA相對表達量（±s）

注：n=3。a：不同濃度組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；b：與上一濃度組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）

組別陰性對照組12.5μmol/LAG490組25μmol/LAG490組50μmol/LAG490組75μmol/LAG490組100μmol/LAG490組F值P值HSF STAT3 1.000±0.000 0.951±0.016ab 0.889±0.015ab 0.832±0.022a 0.806±0.015ab 0.726±0.011ab 133.899＜0.01 p?STAT3 1.000±0.000 0.903±0.030ab 0.773±0.036ab 0.743±0.019ab 0.654±0.027a 0.522±0.019ab 141.904＜0.01 HKF STAT3 1.000±0.000 0.852±0.017ab 0.724±0.010ab 0.653±0.020ab 0.554±0.030ab 0.448±0.020ab 354.610＜0.01 p?STAT3 1.000±0.000 0.756±0.031ab 0.662±0.025ab 0.551±0.011ab 0.479±0.024ab 0.328±0.027ab 337.040＜0.01 HKF STAT3mRNA 1.0070±0.0860 0.9620±0.0208 0.8550±0.0192ab 0.7065±0.0316ab 0.5907±0.0280ab 0.4228±0.0235ab 116.024＜0.05 Cyclin D1mRNA 1.0016±0.0396 0.6044±0.0211ab 0.5374±0.0127ab 0.4724±0.0140ab 0.3987±0.0127ab 0.2494±0.0144ab 50.880＜0.05

本研究采用RT?PCR技術從mRNA水平驗證HKF中STAT3mRNA的高表達，從而進一步證明了本研究設計的可行性。CCK?8法檢測發(fā)現(xiàn)，AG490能抑制HSF、HKF的增殖，且該抑制作用呈濃度和時間依賴性，但對HSF的增殖抑制作用要小于HKF。流式細胞儀檢測顯示，AG490能阻滯HKF細胞周期的進程，將細胞阻滯于G1期，且AG490濃度越高，對細胞周期的影響越強。HKF細胞凋亡率亦隨AG490濃度的增加而增加，提示AG490可以通過阻滯細胞周期的進程進而抑制HKF生長并誘導其凋亡。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HSF、HKF中STAT3及p?STAT3蛋白表達水平隨AG490濃度的增加而降低，且HKF的下降水平比HSF更為顯著。結合RT?PCR的結果，AG490可抑制HKF中STAT3mRNA的表達，提示AG490作用于HKF一方面可以抑制STAT3 mRNA的表達，另一方面能阻斷STAT3蛋白及其磷酸化。p?STAT3在HKF膠原沉積中有重要作用，且Ⅰ型和Ⅲ型膠原在瘢痕疙瘩中高表達［9］。有研究表明［2］，STAT3能直接影響Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的轉(zhuǎn)錄，通過抑制STAT3的表達，減少膠原產(chǎn)生，抑制HKF的增殖和遷移。提示AG490可通過抑制STAT3蛋白的激活及STAT3mRNA的高表達，減少Ⅰ型和Ⅲ型膠原產(chǎn)生，抑制HKF的增殖和遷移。

此外，AG490可抑制HKF細胞中STAT3、Cyclin D1mRNA的表達，且該抑制作用隨濃度的增加而增強。Cyclin D1mRNA與STAT3mRNA相對表達量呈正相關，說明STAT3mRNA的表達可能對Cyclin D1mRNA的表達存在一定的調(diào)控作用。Cyclin D1是STAT3細胞信號傳導的下游分子，是細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換調(diào)控的一個正性調(diào)節(jié)因子，過度表達的Cyclin D1能縮短G1期，使細胞提前進入S期，導致細胞持續(xù)增殖［10］。提示AG490通過抑制STAT3 mRNA的表達，下調(diào)其下游靶基因Cyclin D1的表達，從而引起HKF細胞周期G1期的停滯，抑制HKF的持續(xù)增殖。

綜上所述，我們推測AG490可通過選擇性阻斷JAK2/STAT3信號通路，有效抑制HKF增殖。但AG490是通過直接還是間接途徑阻斷STAT3激活、通過哪些細胞因子對STAT3mRNA的表達產(chǎn)生抑制作用、是否還可以通過別的通路抑制HKF的增殖、以STAT3信號通路激活劑進行干預是否對HKF的增殖產(chǎn)生正性調(diào)節(jié)等，有待進一步研究。

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Effects of a selective inhibitor of JAK 2/STAT3 signaling pathway,AG490,on the biological behavior of human keloid?derived fibroblastsand their possiblemechanism s

Sun Yuexin,Zhou Ying,Bao Jun
Department of Dermatology and Venereology,Nanjing Drum Tower Hospital,The Affiliated Hospital of Nanjing University MedicalSchool,Nanjing 210008,China

Bao Jun,Email:baojun1968@sina.com

Objective To estimate effects of AG490,a selective inhibitor of JAK2/STAT3 signaling pathway,on the biological behavior of human keloid?derived fibroblasts（HKFs）,and to explore their possiblemechanisms.MethodsIn vitrocultured human skin fibroblasts（HSFs）and HKFs were both divided into several groups to be treated with AG490 at different concentrations（12.5,25,50,75,100μmol/L）,with those receiving no treatment serving as the control group.Then,cell counting kit?8（CCK?8）assaywas performed to evaluate cellular proliferative activity of HSFs and HKFs after 24?,48?and 72?hour treatment,flow cytometry to estimate cell cycle distribution and apoptosis rate in HKFs after 24?hour treatment,reverse transcription（RT）?PCR tomeasure STAT3 and cyclin D1 mRNA expressions in treated HKFs aswell as STAT3mRNA expression in untreated HSFs and HKFs after 24?hour culture,and Western blotanalysis tomeasure the protein expressions of STAT3 and p?STAT3 in HSFs and HKFs after 24?hour treatment.Results CCK?8 assay showed that the proliferation inhibition rates of both HSFs and HKFs gradually increased alongwith the increase in AG490 concentrations and treatmentduration,and the inhibitory effects increased in both dose?and time?dependentmanners（allP＜0.05）.Besides,when cellswere treated with the same concentrations of AG490 for same durations,the proliferation of HKFswere inhibited to a greater extent than that of HSFs（allP＜0.05）.As flow cytometry revealed,along with the increase of AG490 concentrations,the proportion of HKFs in G1 phase and the apoptosis rate in HKFs both increased gradually（allP＜0.01）,while the proportion of HKFs in G2 phase gradually decreased（allP＜0.01）,and the proportion ofHKFs in Sphase remained insignificantly changed.RT?PCR showed that themRNA expression of STAT3 was significantly higher in untreated HKFs than in untreated HSFs after 24?hour normal culture（P＜0.05）.After 24?hour treatmentwith AG490,themRNA expressions of STAT3 and cyclin D1 in HKFs gradually decreased with the increase of AG490 concentrations.Correlation analysis revealed that themRNA expression of cyclin D1 was positively correlated with thatof STAT3 in AG490?treated HKFs（r=0.855,P＜0.01）.Western blot analysis showed that the protein expressions of both STAT3 and p?STAT3 gradually decreased in HKFs and HSFs along with the increase of AG490 concentrations（allP＜0.05）,and were significantly lower in HKFs than in HSFs（bothP＜0.05）.Conclusion AG490 can effectively inhibit HKF proliferation by selectively blocking the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Keloid;Fibroblasts;Cyclin D1;STAT3 transcription factor;AG490

包軍，Email：baojun1968@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.11.03

南京市醫(yī)學科技發(fā)展項目（YKK10068）

Fund program:Key Project Supported by Medical Science and Technology Development Foundation,Nanjing DepartmentofHealth（YKK10068）

2016?02?14）

（本文編輯：周良佳顏艷）