林春花劉德永范乃立夏劍輝廖維林（江西師范大學(xué)國家單糖化學(xué)合成工程技術(shù)研究中心，化學(xué)化工學(xué)院，南昌 33007）

超高效合相色譜-質(zhì)譜法分析研究單甘酯乳化劑中單甘酯的主要組成

林春花1劉德永1范乃立1夏劍輝*2廖維林1
（江西師范大學(xué)國家單糖化學(xué)合成工程技術(shù)研究中心1，化學(xué)化工學(xué)院2，南昌 330027）

建立了超高效合相色譜-質(zhì)譜（UPC2-MS）快速分析3種單甘酯乳化劑（單油酸甘油酯、單亞油酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯）中單棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯和單亞油酸甘油酯等4種主要的單甘酯的方法，并比較了這3種不同類別的乳化劑中此4種單甘酯的含量差異。采用正己烷/異丙醇（7∶3，V/V）直接溶解樣品，以ACQUITY UPC2BEH 2-EP色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）為分析柱，以超臨界CO2-甲醇/乙腈（1∶1，V/V）為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min。在電噴霧正離子模式下進行分析，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：單棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單亞油酸甘油酯在0.20～50 mg/L范圍內(nèi)具有良好線性，單油酸甘油酯在0.25～62.5 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性（相關(guān)系數(shù)不小于0.9983）；定量限（S/N≥10）為0.018～0.046 mg/L；在3個加標(biāo)水平下，樣品的回收率在88.0%～110.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1% ～4.1%。本方法簡單、快速、分離效果好，無需對單甘酯樣品進行衍生化，為乳化劑中單甘酯的含量分析提供了一種新的色譜技術(shù)手段。

超高效合相色譜-質(zhì)譜法；單甘酯；乳化劑；未衍生化

1 引言

乳化劑是一種能改善乳化體中各種構(gòu)成相之間的表面張力，穩(wěn)定乳濁液的添加劑。單甘酯是食品行業(yè)重要的乳化劑［1］，按照主要組成脂肪酸（C16～C18）的名稱可以將其分為單棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯等飽和脂肪酸單甘酯和單油酸甘油酯、單亞油酸甘油酯等不飽和脂肪酸單甘酯［2，3］。一直以來，單甘酯的生產(chǎn)對象主要為飽和脂肪酸單甘酯，且單硬脂酸甘油酯使用的最多，它幾乎成了單甘酯的代名詞。近年來，研究發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸單甘酯，具有更低的表面張力和更好的乳化能力［4，5］，是一種更為優(yōu)良的食品乳化劑和保健食品添加劑。因此，對單甘酯乳化劑制品中單甘酯的主要組成進行分析，將有助于產(chǎn)品質(zhì)量的提高以及食品安全風(fēng)險的控制。

單棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯和單亞油酸甘油酯等單甘酯結(jié)構(gòu)類似，分子量相差不大，沸點較高。現(xiàn)有的分析方法有化學(xué)滴定法［6］、TLC［7］、GPC［8］、GC［9～12］、HPLC-UV/RID/ ELSD［4，13～16］等?；瘜W(xué)滴定法易使單甘酯的測定結(jié)果偏高，且不適合對樣品中存在不飽和脂肪酸單甘酯進行分析［15，17］；TLC操作簡單，但定量分析不太準(zhǔn)確［18，19］；GPC只能測定單甘酯總量，不能對上述4種單甘酯進行完全分離；GC是較常用的方法，直接分析樣品時需要高溫測試條件，色譜柱的使用壽命大大降低，而間接分析樣品時需要進行衍生化處理，過程繁瑣且影響產(chǎn)物的準(zhǔn)確測定［20］；HPLC-ELSD法雖無需樣品衍生化，但分析時間較長，檢測限較高。近年來，隨著UPLC色譜技術(shù)的發(fā)展，在一定程度上彌補了HPLC的不足。因此，建立一種更為簡便且分離度更高的測定單甘酯的方法很有必要。

超高效合相色譜（UPC2）是基于超臨界流體色譜（SFC）的基本原理而發(fā)展起來的一種新型色譜技術(shù)，它集合了SFC和UPLC兩者的優(yōu)勢，開辟了分離科學(xué)的新領(lǐng)域［21］。分析現(xiàn)有研究成果發(fā)現(xiàn)，SFC是分析脂類物質(zhì)方法中選擇性較好的方法［22］。而UPC2繼承和發(fā)展了SFC的優(yōu)勢，是新一代快速、準(zhǔn)確分析單甘酯的技術(shù)手段。本研究就是利用UPC2對單甘酯乳化劑中4種主要的單甘酯進行分析測定，不但驗證了UPC2方法的科學(xué)性和可行性，同時也為評價單甘酯乳化劑的品質(zhì)提供了數(shù)據(jù)參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY UPC2系統(tǒng)（美國Waters公司），配Waters SQD 2質(zhì)譜檢測器。ACQUITY UPC2HSS C18SB色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）、ACQUITY UPC2BEH色譜柱（100 mm×3 mm，1.7μm）、ACQUITY UPC2BEH 2-EP色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）和ACQUITY UPC2CSHTMFluoro-Phenyl Column色譜柱（100 mm×3 mm，1.7μm）（美國Waters公司）。METTLER TOLEDO AL204型電子天平（瑞士METTLER公司）。PURELAB Ultra MK 2型超純水儀（英國ELGA公司）?？烧{(diào)式移液器（上海大龍公司）。

4種單脂肪酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品：單棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯和單亞油酸甘油酯（純度大于99%，Sigma Aldrich公司）；甲醇、乙腈、正己烷和異丙醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸、甲酸銨（色譜級，上海安譜公司）；醋酸銨（色譜級，美國Fluka公司）；實驗用水為超純水。單硬脂酸甘油酯乳化劑、單油酸甘油酯乳化劑和單亞油酸甘油酯乳化劑均為市售。

2.2 實驗條件

2.2.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPC2BEH 2-EP；流動相：超臨界CO2（A）和甲醇-乙腈（1∶1，V/V）（B）。洗脫梯度：0～2 min，3.5%～5%B；2～3 min，5%B；3～5 min，5%～12%B；5～6min，12%～3.5%B。柱溫：45℃；樣品室溫度：10℃；背壓：1.103×107Pa；流速：1.0 mL/min；進樣體積：1 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件離子源：ESI+；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30V；源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣體流速：800 L/h；錐孔氣體流速：30 L/h；補償溶劑：10 mmol/L甲酸銨溶液，流速為0.2 mL/min；選擇離子監(jiān)測模式下，單棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯和單亞油酸甘油酯的m/z分別為348.50，376.56，374.54，372.56（［M+NH4］+），提取離子色譜圖如圖1所示。

圖1 4種單脂肪酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品在ESI+模式下的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the four monoglyceride standards in ESI+mode

2.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取單棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯和單亞油酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷/異丙醇（7∶3，V/V）溶解，依次配成濃度為1.000 g/L，1.000 g/L，1.250 g/L，1.000 g/L的單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。移取不同體積的各單甘酯標(biāo)準(zhǔn)溶液混合配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.4 樣品制備分別稱取0.01 g（精確至0.0001 g）單硬脂酸甘油酯乳化劑、單油酸甘油酯乳化劑和單亞油酸甘油酯乳化劑等樣品，用正己烷-異丙醇（7∶3，V/V）溶解并定容至100 mL，經(jīng)有機膜過濾后待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

UPC2系統(tǒng)可以使用傳統(tǒng)正相和反相色譜柱的填料，為開發(fā)分離方法提供了多種選擇性。本實驗首先考察了4種不同填料的ACQUITY UPC2色譜柱對單甘酯分離的影響，它們分別為BEH，BEH 2-EP，HSS C18SB及CSHFluoro-Phenyl。由圖2可見，除HSS C18SB柱外，其它色譜柱的出峰順序相似。BEH柱和BEH 2-EP柱對單甘酯混合物的選擇性最好，都能夠?qū)崿F(xiàn)4種單甘酯的有效分離。但BEH 2-EP柱的極性小于BEH柱，更適合分離極性較大的單甘酯混合物，具有較理想的分析時間和選擇性，因此本實驗選用BEH 2-EP色譜柱。

圖2 不同色譜柱對4種單脂肪酸甘油酯分離效果的影響Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the separation of four monoglycerides Peaks：1.1-Monopalmitin；2.1-Monostearin；3.1-Monoolein；4.1-Monolinolein.

3.2 洗脫梯度的選擇

洗脫梯度的變化會對目標(biāo)物的保留時間和分離度產(chǎn)生一定的影響。本實驗考察了3組不同的洗脫梯度的方法（方法1：0～2 min，1.5%～5%B；2～3 min，5%～12%B；3～4 min，12%B；4～6min，12% ～1.5%B，方法2：0～2 min，3.5%～5%B；2～3 min，5%B；3～5 min，5%～12%B；5～6 min，12%～3.5%B，方法3：0～2 min，3.5%～12%B；2～3 min，12%B；3～6 min，12%～3.5%B）。由圖3可見，共溶劑中流動相B的含量越高，保留時間越短（方法1＞方法2＞方法3）；洗脫梯度的斜率越大，分離度越小（方法2＞方法1＞方法3）。綜合考慮分離度和保留時間，最終選用方法2的洗脫梯度。

3.3 柱溫的選擇

改變柱溫會在一定程度上影響UPC2的分離效果，所以實驗中以混合標(biāo)準(zhǔn)品為對象，在改性劑為甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、流速為1.0 mL/min和背壓1.103×107Pa的條件下，考察柱溫（35℃，45℃，55℃）對分離效果的影響。由圖4可見，隨著柱溫升高，目標(biāo)物的保留增大，這是因為升高溫度會降低CO2的密度，從而減弱其洗脫能力，導(dǎo)致化合物的保留值增大；同時目標(biāo)物的分離度隨著溫度的升高而有所增加，當(dāng)升高至55℃時增幅不大，因此選用45℃柱溫。

圖3 不同的洗脫梯度對4種單甘酯分離度和保留時間的影響Fig.3 Effect of elution gradients on resolution and retention time of four monoglycerides

圖4 溫度對4種單干酯分離效果的影響Fig.4 Effect of temperature on the separation of four monoglycerides

3.4 背壓的選擇

背壓的改變也會在一定程度上影響UPC2的分離效果，所以在改性劑為甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、流速1.0 mL/min和柱溫45℃的條件下，考察了不同的系統(tǒng)背壓（1.103×107～1.378×107Pa）對分離效果的影響。結(jié)果如圖5所示，背壓升高造成CO2的密度和黏度增加，從而導(dǎo)致流動相的溶劑化能力和洗脫能力提高，進而使得化合物的保留時間縮短；同時，背壓升高對分離度影響不大。因此，選擇背壓為1.103×107Pa時，目標(biāo)物的分離效果與保留效果較好。

3.5 MS中補償溶劑的選擇

在LC-MS分離中，一般會使用補償溶劑，以改善峰形和促進目標(biāo)物的分子離子化。在相同的梯度洗脫條件下，流速為0.2 mL/min時，實驗考察了分別含0.1%（V/V）甲酸、10 mmol/L甲酸銨和10 mmol/L醋酸銨的甲醇作為補償溶劑時4種單甘酯的分離情況。由圖6可見，使用甲酸銨、醋酸銨等緩沖鹽作補償溶劑，總離子流圖（TIC）的響應(yīng)值分別為1.40×108和1.33×108，明顯高于使用甲酸的補償溶劑。因此，最終選用甲醇-10 mmol/L甲酸銨作為補償溶劑，目標(biāo)物的離子化效率最好，響應(yīng)靈敏度最高。

圖5 背壓對4種單干酯分離效果的影響F i g . 5 E f f e c t o f b a c k p r e s s u r e o n t h e s e p a r a t i o n o f f o u r m o n o g l y c e r i d e s

圖6 補償溶劑對4種單干酯分離效果的影響Fig.6 Effect of compensation solvent on the separation of the four monoglycerides

3.6 方法評價

配制不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色譜條件下進行檢測，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x，mg/L）進行線性回歸，得到線性回歸方程。向已知含量的乳化劑樣品中分別添加4種成分的單甘酯標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置3個添加水平，每個加標(biāo)水平重復(fù)測定6次，并計算加標(biāo)回收率和精密度。按信噪比S/N≥10計算得到分析方法的定量限（LOQ）。結(jié)果（表1）表明，單棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單亞油酸甘油酯在0.20～50.0 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，而單油酸甘油酯在0.25～62.5 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.9983），3個加標(biāo)水平的回收率在88.0%～110.5%，RSD為1.1%～4.1%，LOQ為0.018～0.046 mg/L，可滿足食品乳化劑中單甘脂的測定要求。

表1 4種單脂肪酸甘油酯的方法評價結(jié)果Table 1 Evaluation of the method for the 4 monoglycerides

運用本方法對市售的3種單甘酯乳化劑（單硬脂酸甘油酯乳化劑、單油酸甘油酯乳化劑、單亞油酸甘油酯乳化劑）樣品進行檢測（表2），結(jié)果表明，3種單甘酯乳化劑中4種1-單甘酯的含量和比例因類別不同而差異較大。其中，單油酸甘油酯乳化劑和單亞油酸甘油酯乳化劑都是以1-油酸單甘酯和1-亞油酸單甘酯等不飽和1-單甘酯為主，它們在上述2種乳化劑中的總含量分別為71.73%和85.92%。單硬脂酸甘油酯乳化劑是以1-單棕櫚酸和1-單硬脂酸甘油酯等飽和1-單甘油酯為主，它們在該乳化劑中的總含量高達91.01%。3種樣品的色譜圖如圖7所示。

表2 實際樣品的分析結(jié)果Table 2 Analytical results of real sample

圖7 單硬脂酸甘油酯乳化劑（a）、單油酸甘油酯乳化劑（b）、單亞油酸甘油酯乳化劑（c）中4種單甘酯的色譜圖Fig.7 UPC2chromatograms of 4 monoglycerides in the monostearin emulsifier（a），monoolein emulsifier（b）and monolinolein emulsifier（c）

4 結(jié)論

通過對色譜柱、洗脫梯度、柱溫、背壓、補償溶劑等條件的優(yōu)化和考察，建立了超高效合相色譜-質(zhì)譜法快速分析單甘酯乳化劑中4種單甘酯的分析方法。本方法采用超臨界CO2作為主要流動相，它具有與液體相近的密度、與氣體接近的粘度及擴散系數(shù)等優(yōu)良性能。同以往色譜分析方法相比，本方法獲得了靈敏度更高和分析速度更快的結(jié)果，為快速、準(zhǔn)確分析單甘酯的主要組成提供了新的技術(shù)手段，同時也為評價單甘酯乳化劑的品質(zhì)提供了數(shù)據(jù)參考。

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2.1.2 料液比 一般情況下，在料液比較大時花青素提取效果較好。山竹果皮花青素提取量隨料液比升高而降低，而溶液中花青素含量隨料液比升高而升高。花青素提取量曲線與溶液中花青素含量曲線出現(xiàn)一個交點，此時，料液比為1∶28。當(dāng)料液比過大時則會造成不必要的溶劑浪費和能源消耗，故正交試驗料液比選用1∶25～1∶35。

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This work was supported by the National Science and Technology Support Project（Nos.2012BAE07B00，2014BAE13B02 ）

Determination of Main Composition of Fatty Acid Monoglyceride in Monoglyceride Emulsifier Using Ultra Performance Convergence Chromatography-Mass Spectrometry

LIN Chun-Hua1，LIU De-Yong1，F(xiàn)AN Nai-Li1，XIA Jian-Hui*2，LIAO Wei-Lin1
（National Monosaccharide Chemical Synthesis Engineering Research Center1，Chemistry and Chemical Engineering Department2，Jiangxi Normal University，Nanchang 330027，China）

A fast analytical method was developed for the determination of main composition of fatty acid monoglycerides，including monopalmitin，monostearin，monoolein and monolinolein，in monoglycerede emulsifiers by ultra-performance convergence chromatography-massspectrometry. Theircontentswere compared in the 3 emulsifiers from different sources.The sample was directly dissolved with n-hexane/isopropanol（7∶3，/V）The chromatographic separation was performed on the ACQUITY UPC2BEH 2-EP column（2.1 mm×100 mm，1.7μm）using the mobile phases of carbon dioxide and methanol/acetonitrile （1∶1，V/V）solution with gradient elution.The separated compounds were detected by MS detector in positive electrospray ionization（ESI+）and quantified by external standard method.The results showed that the calibration curves of monopalmitin，monostearin，monoolein and monolinolein were linear in the range of 0.20-50 mg/L，0.20-50 mg/L，0.25-62.5 mg/L and 0.20-50 mg/L，respectively，with correlation coefficients not less than 0.9983.The limits of quantification（S/N≥10）of the four fatty acid monoglycerides were 0.018-0.046 mg/L.The average recoveries for the four monoglycerides at three spiked levels were 88.0%-110.5%with relative standard deviations of 1.1%-4.1%.The proposed method showed high performance，good selectivity and fast analysis for the underivatized monoglyceride samples.It would provide a new chromatographic technology for the content analysis of monoglycerides in the emulsifier.

Ultra-performance convergence chromatography-mass spectrometry；Fatty acid monoglyceride；Emulsifier；Underivatization

14 July 2015；accepted 21 October 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150558

2015-07-14收稿；2015-10-21接受

本文系國家科技支撐計劃項目（Nos.2012BAE07B00，2014BAE13B02）資助

*E-mail：xjh2168@126.com