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        基于氧化石墨烯熒光適體傳感器的胰島素檢測

        2016-11-01 07:11:18姜利英肖小楠周鵬磊閆艷霞姜素霞陳青華鄭州輕工業(yè)學院電氣信息工程學院鄭州450002
        分析化學 2016年2期
        關(guān)鍵詞:胰島素實驗檢測

        姜利英肖小楠 周鵬磊 張 培 閆艷霞 姜素霞 陳青華(鄭州輕工業(yè)學院電氣信息工程學院,鄭州 450002)

        基于氧化石墨烯熒光適體傳感器的胰島素檢測

        姜利英*肖小楠 周鵬磊 張 培 閆艷霞 姜素霞 陳青華
        (鄭州輕工業(yè)學院電氣信息工程學院,鄭州 450002)

        采用熒光基團(FAM)標記的核酸適體作為識別元件,氧化石墨烯為淬滅劑,建立了一種高選擇性、高靈敏度的核酸適體傳感器。核酸適體與氧化石墨烯結(jié)合后,熒光淬滅,此時溶液無熒光;加入胰島素后,溶液中熒光得到恢復(fù)。利用熒光分析法檢測加入胰島素前后,溶液中熒光強度的變化,獲取了熒光適體傳感器的線性度和靈敏度,實現(xiàn)對胰島素濃度的測定。結(jié)果表明,在5×10-8~1×10-5mol/L范圍內(nèi),胰島素的濃度與溶液中熒光強度有良好的線性關(guān)系,檢出限為10 nmol/L。采用此方法檢測胰島素,操作簡便,檢測速度快,準確性高,選擇性好,檢出限低。

        熒光基團;核酸適體;氧化石墨烯;熒光適體傳感器;胰島素

        1 引言

        胰島素(Insulin,INS)是胰臟中胰島B(β)細胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素,既能促進血液中的葡萄糖進入肝、肌肉和脂肪等組織細胞,在細胞內(nèi)合成糖元或轉(zhuǎn)變成其它營養(yǎng)物質(zhì)貯存起來;又能促進葡萄糖氧化分解釋放能量,供機體利用,是維持血糖在正常水平的主要激素。胰島素分泌不足或缺乏時,會引起高血糖,甚至是糖尿病。因此,能否準確測定血液中胰島素的濃度,對高血糖及糖尿病的早期診斷、臨床和基礎(chǔ)研究具有重要的價值[1,2]。胰島素的檢測方法包括免疫分析法[3]、色譜法[4],這兩種方法操作繁瑣,靈敏度低,難以應(yīng)用到現(xiàn)場即時檢測?,F(xiàn)在研究較多的檢測方法是電化學分析法[5~13]和熒光分析法[14~16]。

        由于核酸適體具有高親和力和高特異性,已成為制備生物傳感器理想的識別元件[17~20]。Seyed等[2]利用了核酸適體和三股螺旋分子開關(guān)的獨特性質(zhì),對胰島素進行檢測,檢出限為9.97 nmol/L。Verdian等[15]基于胰島素適體折疊熒光淬滅,實現(xiàn)了對INS的檢測,檢測范圍為2~70 nmol/L。Ying等[16]以氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)為淬滅劑,基于核酸適體熒光檢測法得到INS的檢出限為500 nmol/L,檢測范圍0.5~50μmol/L。氧化石墨烯可與DNA堿基發(fā)生強烈的π-π相互作用,穩(wěn)定吸附單鏈DNA,使熒光淬滅,它的淬滅效率遠高于常見的有機淬滅劑,且它的生產(chǎn)成本較低、制備簡單,是研究生物傳感器的熱點材料[21~24]。

        本研究采用熒光基團標記的單鏈DNA作為探針,以氧化石墨烯為淬滅劑,構(gòu)建了對INS有特異性的熒光適體傳感器,在檢測范圍與檢出限方面獲取了更好的結(jié)果。

        2 實驗部分

        2.1 儀器與試劑

        GL-16Ⅱ型離心機(上海安亭科學儀器廠);DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);F-7000熒光光譜儀(日本 HITACHI公司)獲得。Tris-HCl緩沖液為(pH 7.4,50 mmol/L Tris-HCl,30 mmol/L NaCl,50 mmol/L KCl)。牛胰島素(北京索萊寶科技有限公司);2 mg/mL氧化石墨烯溶液(蘇州恒球科技有限公司)。實驗所用的寡核苷酸序列均由上海生工生物技術(shù)有限公司(中國)合成,其核苷酸序列如下:5′-GGT GGT GGG GGG GGT TGG TAG GGT GTC TTCFAM-3′。實驗用水均為超純水,實驗溫度為25℃。

        2.2 工作溶液的制備

        將100 μL 100μmol/L核酸適體加入到100 mL Tris-HCl緩沖液中,再加入5 mL GO,室溫下靜置10 min后,加入20 μL 100μmol/L PBA封閉未反應(yīng)位點,即得到工作溶液。取25 mg INS加入25 mL工作溶液中,得到INS的濃度為174.4μmol/L,加入工作溶液稀釋,分別得到0,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,5.0,10.0,50和100μmol/L的待測液各5 mL。裝入離心管內(nèi),離心0.5 h,再靜置1 h,使其充分結(jié)合。

        2.3 樣品的分析

        在激發(fā)波長為480 nm,發(fā)射波長為521 nm的條件下,以不含INS的溶液作為空白對照組,用熒光光譜儀測定不同濃度的INS待測液的熒光強度。以熒光強度對相應(yīng)濃度繪制標準曲線。

        2.4 特異性檢測

        在標準曲線范圍內(nèi)選定濃度為5μmol/L,與檢測INS相同的條件下,分別測定BSA、生物素和鏈霉親和素的熒光強度,與相同濃度的INS的熒光強度作比較,并繪制柱狀圖。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 檢測原理、胰島素的激發(fā)和發(fā)射波長

        利用核酸適體與氧化石墨烯組成的檢測INS熒光適體傳感器,檢測INS的基本原理如圖1所示。當沒有目標分子(INS)加入時,核酸適體表面的熒光基團被GO吸附,溶液中有極其微弱的熒光強度;加入INS后,適體不斷從GO表面游離,溶液中的熒光強度得以恢復(fù)。隨著INS濃度的增大,溶液中的熒光強度也不斷增大。根據(jù)熒光強度的變化可以實現(xiàn)對INS的檢測。

        圖1 檢測胰島素的原理示意圖Fig.1 Mechanism of insulin detection

        分別取3 mL工作溶液和待測液,在熒光光譜儀上先固定一個合適的激發(fā)波長,優(yōu)化發(fā)射波長(500~600 nm);確定發(fā)射波長,優(yōu)化激發(fā)波長。最終確定胰島素的激發(fā)波長為480 nm,發(fā)射波長為521 nm,激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度設(shè)置為10 nm。

        3.2 核酸適體與GO的量比對熒光強度的影響

        若核酸適體的量過大,GO不能將適體完全吸附,溶液中還存在大量熒光,當加入INS后,熒光強度的變化不夠明顯,對實驗結(jié)果有較大影響。若GO量過大,核酸適體的熒光被GO完全吸附后,溶液中無熒光,但存在一部分未與核酸適體結(jié)合的GO,加入INS時,從GO表面游離的核酸適體有可能再次被GO吸附,影響實驗結(jié)果的準確性。核酸適體與GO不同的量比測得溶液中的熒光強度如圖2所示。由圖2可得,最終選擇適體與GO的比例為1 nmol∶1 mg(曲線c),此時GO將完全吸附適體,熒光即將會完全淬滅。

        3.3 緩沖液濃度對熒光強度的影響

        緩沖溶液的濃度可以影響核酸適體的熒光強度,從而影響最終測得INS的熒光強度。本實驗考察了不同濃度的緩沖液(50 nmol/L,50μmol/L,50 mmol/L)對最終實驗結(jié)果熒光強度的影響,發(fā)現(xiàn)緩沖液濃度為50 mmol/L時,測得熒光強度最強,實驗效果最好。最終確定緩沖液為Tris-HCl 50 mmol/L,NaCl 30 mmol/L,KCl 50 mmol/L。

        圖2 不同DNA與GO的比率相對應(yīng)的熒光強度Fig.2 Fluorescence intensity corresponding to different ratios of DNA and GO

        3.4 工作溶液與胰島素結(jié)合時間對熒光強度的影響

        工作溶液與INS結(jié)合的時間太短(0~30 min),測得熒光強度較弱,延長結(jié)合時間(30~60 min),熒光強度不斷增強。當結(jié)合時間大于60 min,熒光強度趨于穩(wěn)定。最終確定INS與工作溶液的最佳結(jié)合時間為60 min。需要注意的是,INS與工作溶液的結(jié)合時間不宜過長,否則會破壞核酸適體的結(jié)構(gòu),影響實驗結(jié)果的準確性。

        3.5 胰島素的標準曲線及特異性實驗結(jié)果

        在上述實驗條件下,INS濃度與相應(yīng)的熒光強度的關(guān)系如圖3所示,隨著INS濃度增大,熒光強度不斷增強。目標INS的濃度在5×10-8~1×10-5mol/L范圍內(nèi),適體的熒光強度(y)和INS的濃度(x)有良好的線性關(guān)系(圖4),線性回歸方程為y=84.83571+16.0724x,相關(guān)系數(shù)R=0.99913,檢出限為10 nmol/L。

        在圖3的標準曲線上選擇一個濃度(5μmol/L),與檢測INS的條件相同,得到的結(jié)果如圖5所示。INS的熒光強度與牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA),生物素(Biotin)和鏈霉親和素(Streptavidin-biotin)明顯不同,BSA、生物素、鏈霉親和素與胰島素的熒光強度比為1.0∶1.33∶1.07∶8.9。因此,本方法對胰島素具有良好的選擇特異性。

        圖3 胰島素的熒光信號曲線Fig.3 Fluorescent signal curve of insulin

        圖4 胰島素的濃度與熒光強度的關(guān)系曲線Fig.4 Calibration curve of insulin concentration and fluorescence intensity

        3.6 實際樣品的分析

        INS加入到正常人的血清中,再加工作液,配制成不同濃度的待測液,采用本方法測其熒光強度(表1)。結(jié)果表明,本方法的測定結(jié)果與實際樣品誤差很小,每個濃度的樣品平行測定5次,相對標準偏差小于5%,說明本方法具有良好的準確度和精密度。

        表1 實際樣品中胰島素的測定結(jié)果Table 1 Determination results of insulin in real samples

        圖5 胰島素對照組的熒光信號強度(5μmol/L)Fig.5 Fluorescent signal intensity of insulin in control group

        4 結(jié)論

        將能夠與INS特異性結(jié)合的單鏈DNA與GO結(jié)合,構(gòu)建了對INS有特異性的熒光適體傳感器。根據(jù)緩沖液中INS加入前后熒光強度的變化,測定INS濃度,建立了一種快速檢測INS的方法。本方法具有選擇性好、方法簡單、檢測速度快、檢出限低等優(yōu)點。在此實驗基礎(chǔ)上,通過對實驗條件的優(yōu)化或更換淬滅效果更好的淬滅劑,能獲取更好的實驗結(jié)果。若條件允許,預(yù)測此方法在檢測其它蛋白質(zhì)分子方面具有良好的應(yīng)用前景。

        1 Scully T.Nature,2012,485(5):S2-S3

        2 Taghdisiab S M,Daneshcd N M.Anal.Lett.,2015,48:672-681

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        4 Yilmaz B,Kadioglu Y,Capoglu I.J.Chromatogr.Sci.,2012,00:1-5

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        6 Amini N,Gholivand M B,Shamsipur M.J.Electroanal.Chem.,2014,714-715:70-75

        7 Rafiee B,F(xiàn)akhari A R.Biosens.Bioelectron.,2013,(46):130-135

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        楊紹明,李瑞琴,李紅,陳延勝,丁素游.分析測試學報,2015,34(4):395-400

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        高原,李艷,蘇星光.分析化學,2013,41(2):174-180

        23 HUANG He-Zhou,HE Yun-Qiu,LI Wen-You,CHU Xiao-Fei,LI Yi-Ming,CHEN Hui-Min,LIU De-Yu.Chinese Journal of Luminescence,2014,35(2):142-148

        黃河洲,賀蘊秋,李文有,儲曉菲,李一鳴,陳慧敏,劉德宇.發(fā)光學報,2014,35(2):142-148

        24 DONG Hao,ZHAO Xiao-Hui,QU Liang-Dong,CHI Xue-Fen.Chinese Journal of Luminescence,2014,35(7):767-771

        董浩,趙曉暉,曲良東,遲學芬.發(fā)光學報,2014,35(7):767-771

        This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.61002007 )

        An Aptamer-based Fluorescence Biosensor for Insulin Detection Based on Graphene Oxide

        JIANG Li-Ying*,XIAO Xiao-Nan,ZHOU Peng-Lei,ZHANG Pei,YAN Yan-Xia,JIANG Su-Xia,CHEN Qing-Hua (Zhengzhou University of Light Industry,Institute of Electrical and Information Engineering,Zhengzhou 450002 China)

        By using fluorophore(FAM)labeled aptamers as recognition elements and graphene oxide as a quencher,a highly selective and sensitive sensor was constructed for the fast and accurate detection of insulin. After the aptamer binding with graphene oxide,fluorescence will be quenched and fluorescence intensity disappeared;after addition of insulin,the solution fluorescence was restored.Based on the fact,we established a method for the determination of insulin concentration by measuring the fluorescence intensity. The results showed that the concentration of insulin in the range of 5×10-8-1×10-5mol/L had a good linear relationship with the fluorescence intensity.The detection limit was 10 nmol/L.This method of detecting insulin had obvious advantages of fast detection speed,high selectivity and low detection limit.

        Fluorophore;Aptamer;Graphene oxide;Fluorescence aptamer biosensor;Insulin

        3 July 2015;accepted 13 November 2015)

        10.11895/j.issn.0253-3820.150534

        2015-07-03收稿;2015-11-13接受

        本文系國家自然科學基金(No.61002007)、河南省科技創(chuàng)新人才計劃(No.124100510001)、鄭州輕工業(yè)學院2014年度研究生科技創(chuàng)新基金資助項目(No.2014010)、鄭州輕工業(yè)學院博士科研基金資助項目(No.2014BSJJ041)

        *E-mail:jiangliying@zzuli.edu.cn

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