壽崟,劉苗苗,周俊梅,劉素君,徐斯偉,楊洋,張開勇,張必萌

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電針對膝骨關(guān)節(jié)炎MIA模型大鼠軟骨組織中Ⅰ型膠原蛋白基因表達(dá)的影響

壽崟1,2,劉苗苗2,周俊梅2,劉素君2,徐斯偉2,楊洋2,張開勇2,張必萌2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院,上海 200080)

目的 觀察抑制Ⅰ型膠原蛋白基因表達(dá)是否為電針改善膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。方法 將40只成年SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、藥物組和電針組,每組10只。采用注射單體碘乙酸鈉(MIA)并驅(qū)趕大鼠運(yùn)動來建立膝骨關(guān)節(jié)炎MIA模型,藥物組造模后采用塞來昔布溶入到10%DMSO中進(jìn)行灌胃,電針組采用電針足三里、陽陵泉治療。比較各組大鼠治療前后痛閾及軟骨組織內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平的變化情況。結(jié)果 模型組、藥物組及電針組大鼠造模后痛閾與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。藥物組和電針組大鼠處死前痛閾與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＜0.01)。藥物組大鼠處死前痛閾與電針組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組、藥物組及電針組大鼠Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。藥物組和電針組大鼠Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。電針組大鼠Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)與藥物組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。結(jié)論 電針與藥物對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能與抑制Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)有關(guān)。

針刺;電針;骨關(guān)節(jié)炎,膝關(guān)節(jié);單體碘乙酸鈉;Ⅰ型膠原蛋白

膝關(guān)節(jié)是骨關(guān)節(jié)炎的好發(fā)部位,膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)以膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、活動受限為主要特征,患者常因關(guān)節(jié)疼痛而求治[1-3]。針灸是世界公認(rèn)治療KOA的優(yōu)選替代療法,具有安全、有效、副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。臨床實(shí)踐表明,針灸對改善KOA的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形及活動受限等臨床癥狀方面療效顯著[7]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究[8-9]也表明,針灸能較好地緩解局部的腫脹和疼痛,促進(jìn)KOA患者關(guān)節(jié)滲出液的吸收,改善患者關(guān)節(jié)周圍的血液循環(huán),消除炎癥反應(yīng),而且對骨贅有明顯的改善作用,但其具體起效機(jī)制尚不明確。研究表明,在正常的軟骨中Ⅰ型膠原蛋白的含量甚微,已有研究發(fā)現(xiàn)在骨性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨中Ⅰ型膠原蛋白含量增加[10-11]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察電針治療KOA MIA模型大鼠過程中軟骨組織中的Ⅰ型膠原基因表達(dá)的變化,研究電針對Ⅰ型膠原蛋白的調(diào)控機(jī)制,為電針治療KOA的可能作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物分組及處理

40只成年SD雄性大鼠,體重為(280±20)g,由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(滬)2003-0003]。SD大鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)10 d。所有實(shí)驗(yàn)動物在相同標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(GB14925-2001)下飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn),予以自然照明、飲水和飲食。實(shí)驗(yàn)前于每日同一時間將大鼠放在測痛儀的玻璃罩內(nèi)進(jìn)行測痛環(huán)境適應(yīng)。采用查隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、藥物組和電針組,每組10只。各組在造模前、造模后2星期(治療前)及治療后各檢測痛閾1次,隨后處死動物并取材。所有實(shí)驗(yàn)方法均經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動物倫理委員會通過。

1.2 主要試劑與儀器

碘乙酸鈉(MIA)、Trizol、二甲基亞砜(DMSO)試劑(美國Sigma公司),水合氯醛(國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司)。

TF型光熱測痛儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、韓氏LH202H穴位電針儀(中國北京華衛(wèi)有限公司)、塞來昔布膠囊(美國輝瑞制藥有限公司)。其他涉及的試劑及儀器均由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 造模與治療方法

除正常組外,其余各組大鼠在造模前檢測痛閾后,以水合氯醛(40 mg/kg,腹腔注射)麻醉,將0.3 mg單體碘乙酸鈉(monomer sodium iodic acid, MIA)溶液注入大鼠左側(cè)膝骨關(guān)節(jié)腔內(nèi),并配合持續(xù)的抽屜樣關(guān)節(jié)運(yùn)動。具體操作步驟為,將3 mg MIA溶入到50mL0.9%的生理鹽水中,清理關(guān)節(jié)附近的鼠毛,將關(guān)節(jié)屈曲到最大限度后于左膝關(guān)節(jié)腔注入配置好的溶液,于右膝處注入同等劑量的生理鹽水。正常組用同樣的方法于兩膝注入50mL生理鹽水。所有老鼠每日同時做相同的驅(qū)趕運(yùn)動約30 min。

電針組于造模的同時予以電針治療。取足三里、陽陵泉穴。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜》。常規(guī)消毒后,采用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.25 mm×40 mm毫針進(jìn)行針刺,得氣后接穴位電針儀,采用疏密波形,頻率為2/100 Hz,強(qiáng)度為1～3 mA,串長為30 s,每10 min遞增1次,持續(xù)30 min,以局部肌肉輕微抖動為度。每日1次,連續(xù)治療14 d。

藥物組于造模的同時予以藥物治療。將塞來昔布膠囊溶入到10%的DMSO中,給予每只大鼠3 mg/kg的灌胃量。每日1次,連續(xù)治療14 d。

1.4 痛閾檢測方法

在適宜溫度、濕度及安靜的環(huán)境下,采用熱輻射法,以TF型光熱測痛儀輻射熱照射大鼠尾部(距尾尖1.0 cm處)至出現(xiàn)甩尾反射潛伏期(S)為痛反應(yīng)值。每次測量重復(fù)3次,間隔5 min,3次測量結(jié)果的平均值作為1次耐痛閾值,測量均于下午進(jìn)行。

1.5 取材

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,稱量各組大鼠體重,麻醉后固定于手術(shù)臺,伸直關(guān)節(jié),切開皮膚,將整個關(guān)節(jié)取下攝像保存并作大體觀察。切開皮下組織、深筋膜,切斷內(nèi)外側(cè)副韌帶,顯露出整個膝關(guān)節(jié)面,肉眼觀察膝關(guān)節(jié)面,關(guān)節(jié)軟骨變化并攝像保存。將膝關(guān)節(jié)置于冰上,用銳利刀片取膝關(guān)節(jié)正中部分的軟骨組織約50 mg,去除周圍的脂肪組織,剪碎分裝置于1.5 mL的離心管中,加入Trizol試劑0.5 mL手動勻漿器攪碎組織,于4℃下1000離心20 min,提取上清液置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-PCR反應(yīng)

Ⅰ型膠原蛋白的引物序列為5’-ATGTCTGGTTTG GAGAGAGCA-3’,5’-GAGGAGCAGGGACTTCTTGAG-3’,長度為138 bp;內(nèi)參為GAPDH,引物序列為5’-CCGAGGGCC CACTAAAGG-3’,5’-GCTGTTGAGTCACAGGAGCAA-3’,長度為116 bp。于PCR儀(美國ABI-7500)內(nèi)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為70℃ 5 min,42℃ 60 min,70℃ 10 min,94℃ 15 s,60℃ 34 s,72℃ 15 s,共45個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software分析,用2-ΔCT×100%(ΔCT＝目標(biāo)基因CT值－內(nèi)參GAPDH CT值)表示mRNA相對表達(dá)量作為統(tǒng)計(jì)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用單因素方差分析、檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。偏態(tài)分布資料采用中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(Q1,Q2)表示,組間比較用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點(diǎn)痛閾比較

由表1可見,各組大鼠造模前痛閾比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組、藥物組及電針組大鼠造模后痛閾顯著下降,與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),提示造模成功。藥物組和電針組大鼠處死前痛閾顯著上升,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。藥物組大鼠處死前痛閾與電針組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),提示電針與藥物均具有對抗關(guān)節(jié)炎性疼痛的作用。

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)痛閾比較 (±s,s)

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)痛閾比較 (±s,s)

組別n造模前造模后 處死前 正常組10 9.91±1.149.86±0.9810.22±1.22 模型組1010.17±1.02 7.62±0.611) 7.33±1.061) 藥物組10 9.83±0.99 7.94±0.601) 9.86±1.182) 電針組1010.57±1.21 7.63±0.641) 10.16±0.982)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.2 各組大鼠軟骨組織中Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平比較

由表2可見,模型組、藥物組及電針組大鼠Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),提示Ⅰ型膠原蛋白與炎癥痛相關(guān),在骨關(guān)節(jié)炎早期Ⅰ型膠原蛋白就有大量表達(dá)。藥物組和電針組大鼠Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),提示藥物及電針的鎮(zhèn)痛作用與Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)降低相關(guān)。電針組大鼠Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)與藥物組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),提示電針與藥物在對于抗關(guān)節(jié)炎癥方面療效相近。

表2 各組大鼠軟骨組織中Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平比較 (±s,%)

表2 各組大鼠軟骨組織中Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平比較 (±s,%)

組別n COLLA-I mRNA相對表達(dá)量 正常組101.6407±0.3661 模型組10 6.2727±1.48071) 藥物組10 3.1372±0.90611)2) 電針組10 2.9595±1.56311)2)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種可以致殘的疾病,主要發(fā)生在關(guān)節(jié)部位,尤其是承重關(guān)節(jié),如髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié),其特點(diǎn)是這些部位的組織疼痛和退行性改變[12]。目前關(guān)于軟骨膠原蛋白的研究一直被認(rèn)為是揭示骨關(guān)節(jié)炎的重要突破口之一[13-14]。關(guān)節(jié)軟骨是骨表面的一層間質(zhì)豐富、細(xì)胞少的黏彈性物質(zhì),主要由膠原蛋白及蛋白聚糖等成分組成。在骨性關(guān)節(jié)炎早期,軟骨細(xì)胞所生存的微環(huán)境正逐漸發(fā)生改變,某種條件發(fā)生改變誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白分泌增加,產(chǎn)生的Ⅰ型膠原蛋白不斷向周圍細(xì)胞內(nèi)傳遞并放大外界環(huán)境改變的信號,促進(jìn)軟骨細(xì)胞表型的變化,加速軟骨的退變[15]。

大量國內(nèi)外臨床研究[4,7]表明,電針在治療KOA方面有其獨(dú)特優(yōu)勢,能夠有效緩解KOA引起的疼痛、關(guān)節(jié)僵硬及功能性障礙。臨床上,針灸治療KOA多以局部疏通經(jīng)脈、調(diào)理氣血為主,電針局部足三里、陽陵泉可有效改善膝關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán),減輕滑膜炎癥,起到防衛(wèi)免疫、抗病鎮(zhèn)痛的作用,有利于關(guān)節(jié)炎的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法對電針治療大鼠KOA MIA模型進(jìn)行了研究,并對電針療法的可能作用機(jī)制進(jìn)行探討,證明了電針能夠有效糾正Ⅰ型膠原蛋白在軟骨組織中的異常表達(dá),從而發(fā)揮治療作用,為針灸治療KOA提供了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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Effect of Electroacupuncture on Cartilage Expression of Type ⅠCollagen Gene in a Rat Model of MIA-induced Knee Osteoarthritis

1,2,-2,-2,-2,-2,2,-2,-2.

1.,201203,; 2.’,200080,

Objective To investigate whether inhibiting the expression of type Ⅰ collagen gene is one of the mechanisms of action of electroacupuncture in improving knee osteoarthritis. Methods Forty male adult SD rats were randomized into normal, model, medication and electroacupuncture group, 10 rats each. A rat model of MIA-induced knee osteoarthritis was made by injecting monomer sodium iodoacetate (MIA) and driving rat movement. After model making, the medication group received an oral gavage of celecoxib dissolved in 10% DMSO and the electroacupuncture group, electroacupuncture at points Zusanli and Yanglingquan. Pain thresholds and the levels of cartilage expression of type Ⅰ collagen mRNA were compared between various groups of rats before and after treatment.Results There was a statistically significant difference in pain threshold between the model, medication or electroacupuncture group of rats and the normal group after model making (＜0.01) and between the medication or electroacupuncture group of rats and the model group before sacrifice (＜0.01). There was no statistically significant difference in pain threshold between the medication and andelectroacupuncture groups of rats before sacrifice (＞0.05). There was a statistically significant difference in the expression of type Ⅰ collagen mRNA between the model, medication or electroacupuncture group of rats and the normal group (＜0.01) and between the medication or electroacupuncture group of rats and the model group before sacrifice (＜0.01). There was no statistically significant difference in the expression of type Ⅰ collagen mRNA between the electroacupuncture and medication groups of rats before sacrifice (＞0.05). Conclusion The mechanisms of actions of electroacupuncture and medication in treating knee osteoarthritis may be related to inhibiting the expression of type Ⅰ collagen mRNA.

Acupuncture treatment; Electroacupuncture; Osteoarthritis, knee joint; Monomer sodium iodoacetate; Type Ⅰ collagen

1005-0957(2016)09-1119-03

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.09.1119

2016-04-13

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(2010J007A);上海市第一人民醫(yī)院院級課題(11B10);海派中醫(yī)流派及特色技術(shù)扶持項(xiàng)目(ZYSNXD-CC-HPGC-FC-011)

壽崟(1984 - ),女,主治醫(yī)師

張必萌(1974 - ),男,主任醫(yī)師,Email:pjzhtiger08@ali yun.com