崔明超,崔　文,陳少軍,蔡　偉,江海龍,周海濱,凌慶枝△

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院，浙江寧波 315100；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院嶗山院區(qū)，山東青島266003；4.寧波立華制藥有限公司，浙江寧波 315174)

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·生物信息學(xué)·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.025

基于計算機虛擬篩選技術(shù)的芹菜素靶標的預(yù)測*

崔明超1,2,崔文3,陳少軍1,蔡偉1,江海龍4,周海濱4,凌慶枝1△

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院，浙江寧波 315100；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院嶗山院區(qū)，山東青島266003；4.寧波立華制藥有限公司，浙江寧波 315174)

目的利用計算機虛擬篩選技術(shù)對芹菜素的潛在靶標進行預(yù)測。方法采用PharmMapper網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進行初步預(yù)測，利用PyRx0.8中的Autodock Vina模塊進行分子對接，并結(jié)合文獻挖掘進行驗證，利用Discovery Studio 3.5 對靶蛋白-小分子復(fù)合物的相互作用模式進行分析。結(jié)果PharmMapper篩選顯示芹菜素與胰島素受體、17β-雌二醇脫氫酶1、組織蛋白酶K的結(jié)合較好；結(jié)合文獻挖掘結(jié)果，發(fā)現(xiàn)胰島素受體有相關(guān)實驗研究，而其他2種則少見報道；利用分子對接技術(shù)分析芹菜素與靶蛋白核心氨基酸具有氫鍵、范德華力、靜電作用力等相互作用。結(jié)論芹菜素的潛在靶標最有可能是胰島素受體，而17β-雌二醇脫氫酶1和組織蛋白酶K也存在可能性。

芹菜素；受體，胰島素；組織蛋白酶類；雌二醇脫氫酶類；靶標；虛擬篩選

芹菜素(apigenin，4′,5,7-trihydroxyflavone，C15H10O6)是一種廣泛存在于水果、蔬菜、豆類、茶葉及多種中藥中的天然黃酮類成分[1-2]。研究表明，芹菜素對多種腫瘤細胞的生長和增殖具有抑制作用[3]；具有抗氧化、抗炎、抗高血壓、抗動脈硬化、抗血栓形成、抗焦慮、抗感染等多方面的作用[4]；而且較之槲皮素、山奈黃酮等其他黃酮類化合物其致畸變毒性更低[5]。計算機篩選是建立在理論計算-藥物設(shè)計-化學(xué)合成-生物篩選有機結(jié)合的基礎(chǔ)上，成功的篩選可以大大減少生物篩選的工作量，提高新藥研發(fā)成功的概率[6-7]。本研究采用分子對接技術(shù)的原理是以小分子化合物為探針，在已知結(jié)構(gòu)的靶標數(shù)據(jù)庫中檢索可能與之相結(jié)合的生物大分子，并通過能量匹配和空間的調(diào)整形成分子復(fù)合物，進而預(yù)測藥物發(fā)揮作用的靶標[8]。近年來，有關(guān)芹菜素的藥理活性研究日益廣泛。然而，大多仍然處于簡單的細胞實驗和動物藥效驗證的階段，其作用機制仍尚待進一步闡明。本文以芹菜素為研究對象，以PharmMapper作為靶標的篩選工具，并采用PyRx0.8中的Autodock Vina模塊進行驗證。

1　材料與方法

1.1PharmMapper對靶標的預(yù)測PharmMapper是2010年開發(fā)的一款免費的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，基于Targetbank、Drugbank、bindDB、和PDTD四大數(shù)據(jù)庫利用藥效團匹配法，使其預(yù)測結(jié)果更加可靠[9]。通常從植物、動物或菌物中分離得到的天然產(chǎn)物會具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種作用，但是需要大量的生物實驗加以驗證或者排除，費時費力；另一方面，某些已經(jīng)上市銷售多年的藥物，因為對其分子靶標的認識程度不夠，而沒有認識到它的其他不良反應(yīng)或者新作用。如傳統(tǒng)用來治療高脂血癥的他汀類藥物，近年來發(fā)現(xiàn)同時具有抗腫瘤的作用，其機制仍在進一步研究之中[10]。因此采用計算機虛擬篩選技術(shù)對天然產(chǎn)物進行研究十分有必要。

1.2分子對接驗證從靶蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下載靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)，然后采用蛋白質(zhì)預(yù)處理工具(Protein Preparing Tool，http://dock.cmu.edu.tw/ligand.php)對靶蛋白進行預(yù)處理，提供配體的坐標、結(jié)合位置、半徑信息，并提供質(zhì)子化的靶蛋白文件等。芹菜素與疾病相關(guān)的靶蛋白采用PyRx0.8軟件的Autodock Vina模塊進行分子對接，Autodock Vina較之具有運算速度更快，精度更高的優(yōu)點，是目前最常用的對接軟件之一[11]。對接結(jié)果用分子模擬圖形界面軟件Discovery Studio Visualizer 3.5進行處理。

表1　PharmMapper篩選出的芹菜素與疾病相關(guān)的潛在靶標

1.3評價方法反向?qū)咏Y(jié)果利用PharmMapper的打分函數(shù)給出的結(jié)果fit score作為判斷依據(jù)。正向分子對接采用復(fù)合體中配體和受體蛋白之間的相互作用力作為判斷標準。

2　結(jié)　果

2.1基于PharmMapper的虛擬篩選利用PharmMapper對其數(shù)據(jù)庫的7 000余種靶蛋白進行對接，結(jié)果按照fit score的從大到小進行排序，數(shù)值越大，則其結(jié)合越容易。其結(jié)果見表1(表中略去與疾病無關(guān)的靶蛋白)。另外還可以觀察到配體與各個靶蛋白的藥效團匹配情況，見圖1、表2。

A胰島素受體；B 17β-雌二醇脫氫酶1；C組織蛋白酶K。

圖1　芹菜素與靶蛋白藥效團疊合圖

2.2文獻挖掘通過文獻檢索中國知網(wǎng)和Pubmed數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)芹菜素對Estradiol 17-beta-dehydrogenase 1、Cathepsin的研究少見報道，而對胰島素受體有相關(guān)報道。Basta-Kaim等[12]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可以通過抑制IGF/IGF-IR和PI3K/Akt信號通路而發(fā)揮抑制前列腺癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。因此從數(shù)據(jù)挖掘情況分析，故胰島素受體極有可能是芹菜素重要的作用靶標，而17β-雌二醇脫氫酶1、組織蛋白酶K有進一步研究價值。

2.3基于PyRx的分子對接驗證在上述篩選的基礎(chǔ)上，對潛在的靶標分子利用PyRx0.8軟件中的auto vina模塊中與芹菜素進行分子對接，并對復(fù)合體進行分析。在對接過程中，以靶蛋白自帶的配體位置為參照，其坐標參考蛋白質(zhì)預(yù)處理工具Protein Preparing Tool提供的活性結(jié)合點，見表3。

完成分子對接后，用DSV3.5分析靶蛋白與配體形成的復(fù)合物之間的相互作用情況。芹菜素結(jié)合于胰島素受體(1I44)的活性口袋之中，兩者之間存在著氫鍵作用(THR A:1145),Pi-Pi相互作用力(PHE A：1144)，范德華力作用(PRO A:1104等)，靜電作用力(MET A:1112,GLN A:1111等若干氨基酸)等多種作用力，見圖2。

芹菜素結(jié)合于17β-雌二醇脫氫酶1(1I5R)的活性口袋之中，兩者之間存在著氫鍵作用(ASN A:152),Pi-Pi相互作用力(PHE A：226)，范德華力作用(GLU A:194等)，靜電作用力(LEU A:95,PHE A:192等)等多種作用力，見圖3。

表3　分子對接結(jié)合位點與對接能

圖2　芹菜素與胰島素受體相互作用示意圖

圖3　芹菜素與17β-雌二醇脫氫酶1相互作用示意圖

芹菜素結(jié)合于組織蛋白酶K(1TU6)的A鏈的活性口袋之中，兩者之間存在著氫鍵作用(GLU A:173),范德華力作用(ASN A:192等)，靜電作用力(SER A:172等)等多種作用力(圖4A)。芹菜素結(jié)合于組織蛋白酶K(1TU6)的B鏈的活性口袋之中，兩者之間存在著Pi-Pi相互作用力(TRP B：298)，范德華力作用(GLN B:133等)，靜電作用力(TRP B:302等)等多種作用力，見圖4B。

A：與A鏈；B：與B鏈。

圖4芹菜素與組織蛋白酶K相互作用示意圖

3　討　論

作者利用計算機虛擬篩選技術(shù)對芹菜素的潛在靶標進行了預(yù)測。首先采用PharmMapper網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進行初步預(yù)測，對其數(shù)據(jù)庫的7 000余種靶蛋白進行對接，排除掉目前研究尚無相關(guān)疾病的靶蛋白，剩余3種靶蛋白，胰島素受體(insulin receptor)、17β-雌二醇脫氫酶1 (Estradiol 17-beta-dehydrogenase 1)和組織蛋白酶K(Cathepsin K)。同時，系統(tǒng)還給出了配體與各個靶蛋白的藥效團匹配情況。

然后，采用數(shù)據(jù)挖掘的方法，從數(shù)據(jù)庫(中國知網(wǎng)和Pubmed數(shù)據(jù)庫)中檢索發(fā)現(xiàn)目前芹菜素對Estradiol 17-beta-dehydrogenase 1，Cathepsin K的研究少見報道，但對胰島素受體相關(guān)的研究有報道。

因各軟件的計算方法不同，多種軟件的使用有利于提高其準確率。對接結(jié)果利用PyRx0.8中的Autodock Vina模塊進行驗證，利用Discovery Studio 3.5對靶蛋白-小分子復(fù)合物的相互作用模式進行分析。結(jié)果表明，胰島素受體最有可能是芹菜素的潛在靶標，而17β-雌二醇脫氫酶1和組織蛋白酶K也有可能是其潛在靶標。

虛擬篩選中藥物的陽性率一般為5%～20%[13]，易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，需要有相關(guān)的實驗來驗證。

目前，胰島素受體與配體結(jié)合形成復(fù)合體的機制，以及受體激活機制等最基本問題還需要深入研究[14]。位點突變掃描實驗研究發(fā)現(xiàn)，其潛在位點是位于配體分子表面和疏水核心的特定的殘基[15-16]，本文的分子對接也驗證了這一點。

通過虛擬篩選出來的作用靶點，可以為后續(xù)研究提供可能的作用途徑，指明研究方向。由計算機模擬得到結(jié)果仍需要進一步的實驗驗證。本文為芹菜素的靶標研究、藥理活性與臨床應(yīng)用研究提供了理論支撐。

[1]Miean KH,Mohamed S.Flavonoid (myricetin,quercetin,kaempferol,luteolin,and apigenin) content of edible tropical plants[J].J Agric Food Chem,2001,49(6):3106-3112.

[2]Sulaiman RS,Basavarajappa HD,Corson TW.Natural product inhibitors of ocular angiogenesis[J].Exp Eye Res,2014,129:161-171.

[3]陳況況，章宏慧，陳健初．芹菜素對癌細胞作用機理的研究進展[J]．食品工業(yè)科技，2013，34(3)：392-395．

[4]章宏慧，陳況況，陳健初．芹菜中黃酮類化合物及其生物活性研究進展[J]．食品工業(yè)科技，2013，34(13)：388-391．

[5]Huang CS,Lii CK,Lin AH,et al.Protection by chrysin,apigenin,and luteolin against oxidative stress is mediated by the Nrf2-dependent up-regulation of heme oxygenase 1 and glutamate cysteine ligase in rat primary hepatocytes[J].Arch Toxicol,2013,87(1):167-178.

[6]司書毅，張月琴．藥物篩選:方法與實踐[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007．

[7]李家璜，胡桉，鄭偉娟，等．計算機模擬篩選雷公藤內(nèi)酯醇治療銀屑病的靶標蛋白[J]．中國藥學(xué)雜志，2014(13)：1133-1138．

[8]陳少軍，陳宏降，郭章華．反向分子對接法預(yù)測丹參醇A的潛在靶點[J]．中藥藥理與臨床，2014，30(5)：58-61．

[9]Liu X,Ouyang S,Yu B,et al.PharmMapper server:a web server for potential drug target identification using pharmacophore mapping approach[J].Nucleic Acids Res,2010,38(Web Server issue):W609-W614.

[10]Florence GJ,Gardner NM,Paterson I.Development of practical syntheses of the Marine anticancer agents discodermolide and dictyostatin[J].Nat Prod Rep,2008,25(2):342-375.

[11]Perryman AL,Santiago DN,Forli S,et al.Virtual screening with AutoDock Vina and the common pharmacophore engine of a low diversity library of fragments and hits against the three allosteric sites of HIV integrase:participation in the SAMPL4 protein-ligand binding challenge[J].J Comput Aided Mol Des,2014,28(4):429-441.

[12]Basta-Kaim A,Szczesny E,Glombik K,et al.Prenatal stress affects insulin-like growth factor-1 (IGF-1) level and IGF-1 receptor phosphorylation in the brain of adult rats[J].Eur Neuropsychopharmacol,2014,24(9):1546-1556.

[13]Islam MA,Pillay TS.Exploration of the structural requirements of HIV-protease inhibitors using pharmacophore,virtual screening and molecular docking approaches for lead identification[J].J Mol Graph Model,2015,56(2):20-30.

[14]Sarfstein R,Werner H.Minireview:nuclear insulin and insulin-like growth factor-1 receptors:a novel paradigm in signal transduction[J].Endocrinology,2013,154(5):1672-1679.

[15]Menting JG,Whittaker J,Margetts MB,et al.How insulin engages its primary binding site on the insulin receptor[J].Nature,2013,493(7431):241-245.

[16]Petrenko AG,Zozulya SA,Deyev IE,et al.Insulin receptor-related receptor as an extracellular pH sensor involved in the regulation of acid-base balance[J].Biochim Biophys Acta,2013,1834(10):2170-2175.

Potential targets prediction of apigenin via virtual screening*

Cui Mingchao1,2,Cui Wen3,Chen Shaojun1,Cai Wei1,Jiang Hailong4,Zhou Haibin4,Ling Qingzhi1△

(1.DepartmentofTCM,ZhejiangPharmaceuticalCollege,Ningbo,Zhejiang315100,China;2.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu210023,China;3.LaoshanDistrict,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China;4.NingboLiwahPharmaceuticalCo.Ltd.,Ningbo,Zhejiang315174,China)

ObjectiveTo predict the potential targets of apigenin by virtual screening.MethodsThe targets preliminarily forecast by PharmMapper,were validated by associating data mining and Autodock Vina in PyRx 0.8.Subsequently,receptor-ligand interactions were analyzed by Discovery Studio 3.5.ResultsThe virtual screening by PharmMapper indicated that apigenin coupled well with the disease-related targets including insulin receptor,estradiol 17-beta-dehydrogenase 1,and cathepsin K.According to the data mining,insulin receptor was found in related experimental researches,while the other two had few reports previously.And then,the interactions between apigenin and the target proteins were analyzed by Autodock Vina and Discovery Studio Visualizer 3.5,involving hydrogen bonds,electrostatic forces,van der Waals forces etc.ConclusionThe most potential targets of apigenin were insulin receptor,while 17-beta-dehydrogenase 1 and cathepsin K were also possible.

apigenin;receptor,insulin;cathepsins;estradiol dehydrogenases;targets;virtual screening

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY15H280009);浙江省寧波市自然基金資助項目(2015A610290);鄞州區(qū)農(nóng)業(yè)與社會發(fā)展科技項目(鄞科[2015]69號)。作者簡介：崔明超(1983-)，講師，碩士，主要從事中藥資源與新藥研發(fā)的工作?！?/p>

，E-mail:lingqingzhi@sina.com。

R285.5

A

1671-8348(2016)27-3821-03

2016-02-18

2016-04-06)