屠世曄，王曉凌，毛海波

(1. 奉化市中醫(yī)醫(yī)院， 浙江 奉化 315500；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310009)

·基礎(chǔ)與臨床研究·

IHC2+的胃癌患者HER2/neu基因的擴(kuò)增情況研究

屠世曄1，王曉凌2，毛海波1

(1. 奉化市中醫(yī)醫(yī)院， 浙江 奉化 315500；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310009)

目的：研究IHC2+的胃癌患者HER2/neu基因的擴(kuò)增情況。方法收集胃癌根治標(biāo)本82例，經(jīng)免疫組化證實(shí)均為IHC2+，對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行HER2/neu的FISH檢測(cè)，比較兩者結(jié)果的一致性。結(jié)果FISH檢測(cè)顯示82例IHC為2+的病例中,HER2/neu的陽性率為14.6%(12/82)；≥60歲患者HER2/neu的陽性率明顯高于<60歲，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論對(duì)于IHC為2+的胃癌患者必須進(jìn)行FISH檢測(cè)以明確HER2/neu基因的擴(kuò)增情況。

胃癌；HER2/neu; 熒光原位雜交；免疫組織化學(xué)

Abstract:[Objective] The study on the status of Her2/neu gene amplification in gastric cancer scored IHC2+. [Method] 82 cases of gastric cancer scored IHC2+ were collected. FISH was applied to determine the status of HER2/neu. The results were compared between these two methods. [Result] The positive rate of HER2/neu tested by FISH was 14.6% (12/82) in the 82 cases scored IHC 2+; The positive rate of HER2/neu in ≥60 years-old gastric cancers patients was significantly higher than that in <60 years-old patients (P<0.05). [Conclusion] FISH test was necessary for the patients with gastric cancer scored IHC2+, in order to define the status of HER2/neu amplification.

Keywords: gastric cancer;HER2/neu;immunohistochemistry;flourescence in situ hybridization

HER2/neu(又稱c-erbB-2基因), 定位于人類染色體17q12-21.3，編碼一種185 kd的跨膜酪氨酸激酶受體，是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRs)家族之一。HER2/neu在許多惡性腫瘤的發(fā)展過程中扮演重要角色。該受體蛋白與HER家族成員及其配體之間相互作用，通過細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增殖[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HER2/neu基因的擴(kuò)增和蛋白過表達(dá)廣泛存在于各種上皮性腫瘤中，包括胃癌[2]。目前HER2/neu基因檢測(cè)的常用方法是免疫組化(IHC)和熒光原位雜交(FISH)，前者檢測(cè)蛋白表達(dá)，后者檢測(cè)基因擴(kuò)增。由于檢測(cè)方法、技術(shù)差異以及所選試劑等因素的影響，不同文獻(xiàn)中胃癌HER2/neu陽性率高低不一，IHC檢測(cè)的陽性率范圍為6.8%～34.0%，F(xiàn)ISH陽性率范圍為7.1%～42.6%[3-4]。報(bào)道顯示當(dāng)HER2/neu免疫組化的結(jié)果為1+或者3+時(shí)，兩種方法具有較高的一致性[5]。然而對(duì)于那些HER2/neu為2+的病例則無法直接判斷HER2/neu基因的擴(kuò)增情況。本研究主要探討IHC2+的病例中，IHC和FISH兩種方法對(duì)于檢測(cè)HER2/neu基因的一致性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取奉化市中醫(yī)醫(yī)院2010年1月至2015年1月手術(shù)切除的胃癌根治標(biāo)本82例，經(jīng)免疫組化證實(shí)均為IHC2+，年齡37～86歲，平均年齡(63.5±6.2)歲，術(shù)前均未接受任何放化療。

1.2 主要試劑

兔抗人HER2為北京中杉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，F(xiàn)ISH檢測(cè)用HER2探針購自北京金菩嘉生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法(IHC) 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，采用Envision二步法染色。

1.3.2 熒光原位雜交(FISH) 組織切片，65℃過夜烘烤，二甲苯室溫脫蠟2次，每次10min，梯度乙醇復(fù)水，高溫下水煮30min，2XSSC漂洗2次，每次5min，37℃下于蛋白酶K工作液中孵育15min，2XSSC漂洗2次，每次5min，經(jīng)-20℃預(yù)冷的70%、85%和100%乙醇各2min脫水，自然干燥，將玻片置于雜交儀上進(jìn)行變性雜交，程序?yàn)?3℃5min，42℃16h；程序結(jié)束后玻片經(jīng)46℃預(yù)熱的2XSSC/0.1%NP-40和2XSSC洗滌之后，經(jīng)DAPI復(fù)染，于熒光顯微鏡下選擇合適的濾光片觀察。

1.4 結(jié)果判讀

1.4.1 免疫組化法(IHC) 無染色或<10%腫瘤細(xì)胞膜染色為0；微弱或隱約可見≥10%腫瘤細(xì)胞膜染色或僅有部分細(xì)胞膜染色為1+；≥10%腫瘤細(xì)胞有弱至中等的基地側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色為2+；≥10%腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色為3+；≤10%腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強(qiáng)染色為灶性3+。

1.4.2 熒光原位雜交(FISH) 計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值(Ratio值=20個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/20個(gè)細(xì)胞核中綠信號(hào)總數(shù))。Ratio<1.8為陰性結(jié)果，提示該樣本無HER2基因擴(kuò)增；Ratio≥2.2為陽性結(jié)果，提示樣本中HER2基因發(fā)生擴(kuò)增；Ratio在1.8～2.2之間時(shí)，增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至40個(gè)，若比值≥2.0，則為陽性，比值<2.0，則為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPPS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)82例患者中，男性為60例，女性22例，有56.1%的患者≥60歲；56例標(biāo)本腫瘤直徑大于等于3cm；大部分腫瘤位于幽門部，占總數(shù)的65.9%；根據(jù)Lauren分型，腸型胃癌有35例，彌漫/混合型胃癌47例；低分化胃癌為34例；病理分級(jí)中III級(jí)比例最高為42.7%，而TNM分期中T4的比例是最高的，為52.4%；34例病例中未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

經(jīng)FISH檢測(cè)，12例發(fā)現(xiàn)HER2/neu基因有擴(kuò)增，陽性率為14.6%；≥60歲年齡組中，HER2/neu陽性率為21.7%(10/46),而<60歲年齡組中，HER2/neu陽性率為5.6%(2/36),2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其他組間為發(fā)現(xiàn)HER2/neu與臨床參數(shù)之間具有相關(guān)性(圖1，圖2，表1)。

圖1：IHC和FISH檢測(cè)結(jié)果. A: IHC HER2/NEU++;B: Fish(+),提示HER2基因有擴(kuò)增

圖2 IHC和FISH檢測(cè)結(jié)果. C: IHC HER2/NEU++ ; D: Fish(-),提示HER2基因無擴(kuò)增

臨床資料HER2/neu陽性陰性總數(shù)χ2P年齡(歲)<6023436≥601036464.2340.0396性別男95160女319221.0000*腫瘤大小(cm)<342226≥3848561.0000*腫瘤部位賁門/胃體42428幽門846541.0000*Lauren分型腸型62935彌漫/混合型641470.3080.5791腫瘤分化高/中分化74148低分化529341.0000*病理分級(jí)Ⅰ+Ⅱ63844Ⅲ+Ⅳ632380.0760.7833TNM分期T131821T2-T4952611.0000*淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N062834N1-N3642480.541*

注：*確切概率法

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，病死率高，尤其晚期患者傳統(tǒng)治療療效差。多數(shù)研究證明腫瘤的發(fā)生、預(yù)后都與特定基因的過度表達(dá)有關(guān)。最近的一項(xiàng)Meta分析顯示，HER2的過度表達(dá)與胃癌的Bormann分型、Lauren分型、腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)的狀態(tài)、靜脈浸潤(rùn)等有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)中HER2/neu為IHC2+的胃癌患者并未發(fā)現(xiàn)與這些臨床參數(shù)之間的相關(guān)性，但是患者年齡≥60歲與<60歲，HER2的表達(dá)是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的，關(guān)于其中的分子機(jī)制，需要更多的基礎(chǔ)研究來證實(shí)。在分子靶向治療方面，曲妥珠單抗能有效地緩解胃癌患者的病情，因此準(zhǔn)確地檢測(cè)胃癌HER2/neu基因的擴(kuò)增情況有助于對(duì)患者進(jìn)行臨床治療和預(yù)后評(píng)估。

IHC和FISH是目前用于檢測(cè)HER2/neu擴(kuò)增狀態(tài)的最常用方法。IHC檢測(cè)的是蛋白水平，因成本低，用時(shí)短，易于操作，而且容易掌握，成為最常使用的篩選方法。但它有明顯的缺點(diǎn)，結(jié)果受到很多因素的影響，如固定、修復(fù)方法、一抗的選擇、人為主觀判斷等。FISH檢測(cè)的是基因水平，是一種半定量的方法，減少了主觀因素的干擾，因此結(jié)果更客觀。它的缺點(diǎn)是成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作人員的要求更嚴(yán)。基于FISH方法的敏感性和特異性，F(xiàn)ISH成為判斷HER2/neu基因的金標(biāo)準(zhǔn)。報(bào)道顯示當(dāng)HER2/neu免疫組化的結(jié)果為1+或者3+時(shí)，兩種方法具有較高的一致性[5]。而當(dāng)HER2/neu為IHC2+時(shí)，則無法直接判斷HER2/neu基因的擴(kuò)增情況，必須通過FISH檢測(cè)明確HER2/neu是否存在擴(kuò)增。本組研究表明，IHC2+的胃癌病例中HER2/neu陽性率為14.6%，≥60歲患者HER2/neu的陽性率明顯高于<60歲，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

綜上所述，IHC為2+的胃癌患者聯(lián)合FISH檢測(cè)可以明確HER2/neu基因的擴(kuò)增情況，為胃癌患者的預(yù)后及治療方案提供有力的證據(jù)。

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ThestudyonthestatusofHer2/neugeneamplificationingastriccancerscoredIHC2+

TUShiye1,WANGXiaoling2,MAOHaibo1

(1.Traditional Chinese Midicine Hospital of Fenghua, Zhejiang 315500, China；2. The First Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310009,China)

R446.8

B

1672-0024(2016)05-0049-04

屠世曄(1974-)，女，寧波奉化人，本科，副主任醫(yī)師。研究方向：病理診斷