應(yīng)江輝，蔣佩佩，金燦燦，龐文洋，蔡一奇，朱冠保

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江　溫州　325015，1.燒傷科；2.胃腸外科）

·論著·

microRNA-212對胃癌細胞系SGC7901遷移和侵襲能力的影響

應(yīng)江輝1，蔣佩佩2，金燦燦2，龐文洋2，蔡一奇2，朱冠保2

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江溫州325015，1.燒傷科；2.胃腸外科）

目的：研究人microRNA-212（miR-212）對胃癌細胞系SGC7901遷移和侵襲能力的影響。方法：通過化學(xué)方法合成人成熟型miR-212抑制基因i-miR-212，分別以25、50、75、100 nmol/L濃度通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染SGC7901細胞，同時設(shè)空白組和無序列對照組。采用Real-time PCR、細胞計數(shù)和Transwell小室等實驗方法，分別檢測各組細胞miR-212的表達、miR-212對細胞增殖的影響及miR-212對細胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果：各濃度i-miR-212轉(zhuǎn)染SGC7901細胞后，miR-212表達均降低，以50 nmol/L i-miR-212轉(zhuǎn)染組最佳，較無序列對照組降低約94.60%；50 nmol/L i-miR-212轉(zhuǎn)染組與無序列對照組在細胞計數(shù)上差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在細胞侵襲實驗中50 nmol/L i-miR-212轉(zhuǎn)染組透膜細胞明顯多于無序列對照組（P＜0.01），在遷移實驗中i-miR-212轉(zhuǎn)染組（50 nmol/L）的透膜細胞明顯多于無序列對照組（P＜0.01）。結(jié)論：轉(zhuǎn)染成熟型人i-miR-212能使胃癌細胞系SGC7901細胞中miR-212的表達明顯下降，并能顯著促進胃癌細胞系SGC7901的增殖、遷移及侵襲能力，表明miR-212與胃癌腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。

胃癌；microRNA-212；遷移；侵襲；增殖

胃癌是導(dǎo)致人類死亡的第二大病因［1］，以手術(shù)為主的綜合治療仍是胃癌目前的主要治療方式，但是進展期胃癌術(shù)后的5年生存率仍不理想，而轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響胃癌預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前，已發(fā)現(xiàn)與胃癌相關(guān)的基因有數(shù)千條，如p53、MUC1、CEA、E-cadherin、p16、CD44等［2］，隨著基因芯片技術(shù)在胃癌分子生物學(xué)和預(yù)后分級中的廣泛應(yīng)用研究［3-4］，microRNA（miRNA）與腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的相關(guān)性研究已成熱點。

miRNA是一種非編碼蛋白的小分子RNA，它通過與靶基因3’非編碼區(qū)（3’UTR）互補配對，進而促進目的基因的降解或抑制，從而參與細胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。隨著對miRNA深入研究，miRNAs與腫瘤的關(guān)系也成為腫瘤學(xué)研究的新熱點［6］。研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤與正常組織之間存在miRNA的差異性表達［7-11］，這些差異表達不僅見于腫瘤與正常組織之間，也見于腫瘤的不同分期之間，且與腫瘤的生物學(xué)特性及預(yù)后密切相關(guān)［12-13］。本實驗室通過對胃癌組織篩選實驗發(fā)現(xiàn)人microRNA-212（miR-212）在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)間存在差異性表達，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中miR-212的表達較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組降低2～3倍［8］。

本課題通過化學(xué)方法合成成熟型的人miR-212抑制基因以瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染胃癌細胞系SGC7901細胞，并通過細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）和Transwell小室等系列實驗方法檢測腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，來比較轉(zhuǎn)染組與空白組及無序列對照組之間是否存在差異，并為進一步實驗明確相關(guān)生物分子學(xué)機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌細胞系SGC7901購自中科院上海細胞庫；DMEM購自美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自北京元亨圣馬生物科技公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)所；人成熟型miR-212抑制基因（i-miR-212）由上海吉瑪生物公司合成；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamin 2000（lip-2000）購自美國Invitrogen公司；Matrigel購自美國BD Bioscience公司；Transwell小室購自澳洲Costar公司；PCR Marker（100 bp DNA lad-der）購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；制冰機（AF100，SCOTSMAN，意大利）；Eppendorf 5415R超速低溫離心機購自德國Eppendorf公司；細胞培養(yǎng)箱購自德國Binder公司；分光光度儀購自德國Eppendorf公司；Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染及RNA提取 SGC7901細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)6 h至單層后進行轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法按lip-2000試劑盒說明書進行。設(shè)置i-miR-212劑量分別為25、50、75、100 nmol/L。并設(shè)置無序列對照組及空白組。采用Trizol法提取RNA。提取的總RNA使用紫外分光光度計測量獲得260 nm和280 nm波長下的吸光光度值（A值）。A260/A280＞1.8為RNA質(zhì)量合格，用于下一步實驗。

1.3 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞的miR-212表達

分別提取i-miR-212轉(zhuǎn)染各濃度組、空白組和無序列對照組細胞總RNA，進行Real-time PCR測定，每樣品測3次。包括2個步驟：①RNA反轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)：將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，10 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括2 μL RT Buffer、0.5 μL RT Enzyme Mix、0.5 μL Primer Mix，并根據(jù)總RNA加入量調(diào)解去RNA酶的雙蒸水至10 μL。內(nèi)參miR-let7也同時進行了反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，將反應(yīng)產(chǎn)物對倍稀釋至20 μL后置于-20 ℃保存。②參考文獻［14］中的PCR反應(yīng)方法：以hsa-miR-let7a作為內(nèi)參，檢測miRNA的表達量。利用miRNA特異的正向、反向引物和染料分子標(biāo)記探針對莖環(huán)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行定量檢測，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循環(huán)。同時加做溶解曲線以驗證每個PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。該方法將目的基因與內(nèi)參基因的CT值比較（△CT）后，再將實驗組與空白組比較（△△CT）。故△△CT=樣品的［（hsa-miR-212）CT-（let7a）CT］-空白組第1次檢測的［（hsa-miR-212）CT-（let7a）CT］。

1.4 腫瘤細胞的增殖能力檢測 參照CCK-8試劑盒說明書進行：①將轉(zhuǎn)染24 h的SGC7901細胞以及對照組分別按每孔7×103個接種于96孔培養(yǎng)板（每孔100 μL）中。每組分別接種7孔以作為重復(fù)對照。②24 h后，待細胞貼壁后加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)液、10 μL CCK-8試劑，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。③酶標(biāo)儀于490 nm處測OD值。

1.5 腫瘤細胞的侵襲能力檢測 按Transwell說明書操作：①冰上將matrigel與無血清培養(yǎng)液1∶1稀釋混勻。②將marigel膜加入Transwell小室，37 ℃下凝固成固態(tài)后備用。③SGC7901細胞經(jīng)胰酶消化后用無血清培養(yǎng)液洗2次并計數(shù)。④向Transwell小室上室內(nèi)加入細胞懸液（含10萬個細胞），加入無血清DMEM稀釋至400 μL，各個濃度組設(shè)3個復(fù)孔。⑤下室加入600 μL含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液。造成上下室之間的濃度梯度，趨化細胞向下室侵襲。⑥37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后吸去嵌室內(nèi)的液體，用棉棒將上室表面上的細胞擦去。⑦將嵌室浸入50%甲醇中固定15 min，PBS洗3遍。結(jié)晶紫染色30 min，風(fēng)干。⑧熒光顯微鏡下每個培養(yǎng)孔隨機選5個視野拍照并計算各視野細胞數(shù)，各個濃度組設(shè)3個復(fù)孔。細胞計數(shù)方法：每個小室顯微鏡下隨機選取5個視野，計算出染色細胞數(shù)量，每組3個重復(fù)實驗。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 i-miR-212轉(zhuǎn)染后SGC7901細胞中miR-212的表達 i-miR-212轉(zhuǎn)染組的2-△△CT值在25、50、75、100 nmol/L時分別為0.1544±0.0011、0.0549± 0.0010、0.0479±0.0016、0.0288±0.0006，空白組及無序列對照組2-△△CT值分別為1.0177±0.0514、0.9807±0.0448；轉(zhuǎn)染i-miR-212 25、50、75、100 nmol/L后SGC7901細胞miR-212表達量明顯下降，分別下降84.82%、94.60%、95.53%及97.17%?？紤]到轉(zhuǎn)染劑量過大對細胞毒性作用，遂采用50 nmol/L作為正式轉(zhuǎn)染濃度。見圖1。

2.2 i-miR-212轉(zhuǎn)染后對SGC7901細胞增殖能力的影響 i-miR-212轉(zhuǎn)染24 h后SGC7901細胞的OD值明顯高于空白組和無序列對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），無序列對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CCK-8實驗表明抑制miR-212能明顯提高SGC7901細胞的增殖能力。見表1。

2.3 i-miR-212轉(zhuǎn)染后對SGC7901細胞侵襲能力的影響 i-miR-212轉(zhuǎn)染24 h后，采用Transwell小室侵襲實驗比較各組之間的侵襲力差別。結(jié)果顯示i-miR-212轉(zhuǎn)染SGC7901細胞后穿膜數(shù)明顯高于空白組和無序列對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。無序列對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗表明，抑制miR-212的表達可明顯提高細胞的侵襲力。見表2和圖2。

圖1 Real-time PCR下不同組別之間的miR-212表達量

表1 各組SGC7901細胞增殖能力比較（±s）

表1 各組SGC7901細胞增殖能力比較（±s）

與無序列對照組比：aP＜0.01；與空白組比：bP＜0.01

組別樣本量（孔）OD值i-miR-212轉(zhuǎn)染組71.380±0.070ab無序列對照組71.180±0.038空白組71.167±0.081

表2 各組SGC7901細胞侵襲能力比較（±s）

表2 各組SGC7901細胞侵襲能力比較（±s）

與無序列對照組比：aP＜0.01；與空白組比：bP＜0.01

組別樣本量（孔）透膜細胞數(shù)i-miR-212組15152.933±3.283ab無序列對照組15 46.800±3.877空白組15 44.600±4.068

圖2 顯微鏡下各組SGC7901細胞侵襲能力結(jié)果顯示（×200）

2.4 i-miR-212轉(zhuǎn)染后對SGC7901細胞遷移能力的影響 i-miR-212轉(zhuǎn)染24 h后，采用Transwell小室遷移實驗對比各組細胞之間的遷移能力。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染i-miR-212后SGC7901細胞跨膜細胞數(shù)明顯多于空白組和無序列對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。無序列對照組和空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗表明抑制miR-212的表達明顯提高細胞的遷移力。見表3和圖3。

表3 各組SGC7901細胞遷移能力比較（±s）

表3 各組SGC7901細胞遷移能力比較（±s）

與無序列對照組比：aP＜0.01；與空白組比：bP＜0.01

組別樣本量（孔）透膜細胞數(shù)i-miR-212組15243.600±7.029ab無序列對照組15 75.333±3.994空白組15 76.000±3.066

3 討論

miRNA作為癌基因和抑制癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程已被學(xué)者廣泛認同，不斷有研究報道m(xù)iRNA與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)。有研究［15］報道在B細胞淋巴瘤中miRNA-17-92可通過抑制蛋白E2F1（具有誘導(dǎo)凋亡作用）表達，促進腫瘤的發(fā)生。miRNA-21通過調(diào)控抑癌基因PTEN的表達，影響金屬蛋白酶和磷酸激酶表達，促進肝癌的增殖、遷移和侵襲［16］。miR-196a-2在胰腺癌中表達提示預(yù)后較差［17-18］。在胃癌中有學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-10A表達上調(diào)能增加胃癌細胞的侵襲能力［19］，miR-29表達下調(diào)能顯著抑制胃癌細胞的侵襲、遷移及增殖能力［20］。本研究前期篩選實驗發(fā)現(xiàn)miR-212、miR-125a-5p、miR-143、miR-15b、miR-199a-3p、miR-199a-5在胃癌中均有差異性表達［8］。

圖3 顯微鏡下各組SGC7901細胞遷移能力結(jié)果顯示（×200）

本研究通過轉(zhuǎn)染i-miR-212從而使胃癌細胞系SGC7901中miR-212表達下降，并通過CCK-8及Transwell小室等實驗監(jiān)測i-miR-212轉(zhuǎn)染后SGC7901細胞的增殖、遷移及侵襲能力，實驗結(jié)果證明轉(zhuǎn)染imiR-212后SGC7901細胞增殖、遷移及侵襲能力顯著提高，與前期篩選實驗相互印證，并為后期分子生物學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。miR-212作用于胃癌的機制目前尚不明確，有研究［21］報道m(xù)iR-212可能是通過直接結(jié)合MeCP2的3’-UTR區(qū)域，從而靶向調(diào)節(jié)甲基化CpG結(jié)合蛋白MeCP2，影響細胞甲基化過程。MeCP2是甲基化結(jié)合蛋白（MBDs）家族的重要一員，是一類與甲基化CpG二核苷酸結(jié)合的核蛋白。它對DNA的甲基化過程相當(dāng)重要，因為它直接參與調(diào)節(jié)表觀遺傳。它有2個功能區(qū)域，85個氨基酸的甲基化蛋白直接結(jié)合5-甲基胞嘧啶，104個氨基酸的轉(zhuǎn)錄抑制域影響組蛋白去乙酰化酶［22］。miR-212還可能通過作用于凋亡蛋白PED而增加腫瘤對腫瘤凋亡壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的敏感性［23-25］。miR-212是否還存在其他作用機制目前仍不清楚，有待進一步分子生物學(xué)研究來明確。

以上實驗證實了miR-212在胃癌侵襲、遷移中的作用，并且為miRNA作為基因靶向治療提供了新證據(jù)，相信隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展及模式物種cDNA文庫的不斷完善，miRNA不僅可以作為新的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后提供預(yù)測，并且可以作為新的靶向藥物應(yīng)用于臨床中。

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（本文編輯：吳昔昔）

Effects of microRNA-212 on migration and invasion of gastric cancer cell lines SGC7901

YING Jianghui1，JIANG Peipei2， JIN Cancan2， PANG Wenyang2， CAI Yiqi2， ZHU Guanbao2. 1.Department of Burn Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015； 2.Department of Gastroenterological Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Objective: To investigate the effect of human microRNA212 （miR-212） on the migration and invasion of gastric cancer cell line SGC7901. Methods: The i-miR-212 as the suppressor gene of miR-212 was transfected into SGC7901 cells according to different concentration （25， 50， 75， 100 nmol/L） via lipofectamin 2000. Empty vectors and unrelated fragment were also applied as controls. The expression of mature type miR-212 was detected by real-time PCR. Cell Counting Kit-8 was used to evaluate the effect of miR-212 on the proliferation of SGC-7901 cells， meanwhile Transwell assay for migration and invasion of SGC7901 cells. Results: Real-time PCR showed that cells Transfected with i-miR-212 had significantly low expression of miR-212， with the optimal concentration of miR-212 being 50 nmol/L； the expression of miR-212 was 18 times lower than empty group （P＜0.01）. The Cell Counting Kit-8 showed that the proliferation of cancer cells with i-miR-212（50 nmol/L） was higher than that of the control group （P＜0.01）. The Transwells showed the migration and invasion of cancer cells with i-miR-212 （50 nmol/L） was higher than that of the control group （P＜0.01）， respectively. Conclusion: The i-miR-212 can effectively reduce miR-212 expression and promote the migration and invasion of SGC7901 cells. miR-212 may be a tumor suppressor gene in gastric cancer tumor cells.

gastric cancer； microRNA-212； migration； invasion； proliferation

R73-37；R735.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.09.005

2015-10-20

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y2100660）。

應(yīng)江輝（1986-），男，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

朱冠保，主任醫(yī)師，教授，Email：zgbwmc@126.com。