王瑞麗，戴威，戴元榮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江　溫州　325027，1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.呼吸內(nèi)科）

·論著·

caveolin-1和P21在羅紅霉素抑制哮喘離體氣道平滑肌細胞增殖中的作用

王瑞麗1，戴威1，戴元榮2

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江溫州325027，1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.呼吸內(nèi)科）

目的：探討caveolae/caveolin-1和P21在羅紅霉素抑制離體哮喘大鼠氣道平滑肌細胞（ASMCs）增殖中的作用。方法：復(fù)蘇凍存的哮喘ASMCs，CCK-8法檢測不同濃度羅紅霉素［A組（無羅紅霉素）、R10組（羅紅霉素10 μg/mL）、R25組（羅紅霉素25 μg/mL）、R50組（羅紅霉素50 μg/mL）、R100組（羅紅霉素100 μg/mL）］干預(yù)哮喘ASMCs后細胞的增殖情況，透射電鏡觀察各組caveolae的表達，Western Blot法檢測各組caveolin-1、P21的蛋白表達。結(jié)果：羅紅霉素抑制哮喘ASMCs的增殖作用具有濃度依賴性，隨羅紅霉素濃度增加，caveolae的表達逐漸增加，caveolin-1、P21的蛋白表達亦逐漸增加，且R50組或R100組與A組、R10組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。相關(guān)分析示哮喘ASMCs增殖活性與caveolin-1、P21蛋白表達呈負相關(guān)（r= -0.881、r=-0.951，P＜0.05），caveolin-1蛋白表達與P21蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.957，P＜0.01）。結(jié)論：羅紅霉素可能通過上調(diào)caveolae/caveolin-1的表達，引起P21蛋白表達增加，從而抑制離體哮喘ASMCs的增殖。

哮喘；氣道平滑肌細胞；caveolae；caveolin-1；P21；羅紅霉素

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，持續(xù)氣道炎癥可引起氣道重塑。氣道重塑可導(dǎo)致哮喘患者不完全可逆的氣流受限和進行性肺功能下降，與哮喘的嚴重程度相關(guān)［1］。研究［2］表明，氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖是哮喘氣道重塑的重要特征之一。微囊（caveolae）是細胞質(zhì)膜上內(nèi)陷的燒瓶樣結(jié)構(gòu)，微囊蛋白-1（caveolin-1）是caveolae的重要標(biāo)記蛋白。研究［3］表明，caveolae、caveolin-1的缺失，與細胞的過度增殖有關(guān)。P21Waf1/Cip1是重要的細胞周期負性調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控真核細胞有絲分裂過程中的G1/S限制點。羅紅霉素屬新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，已有研究［4-5］表明，羅紅霉素可以抑制哮喘氣道重塑，但其機制并未完全闡明。本研究通過不同濃度羅紅霉素干預(yù)離體哮喘ASMCs，電鏡觀察各組ASMCs caveolae表達情況、Western Blot法檢測各組caveolin-1、P21的表達水平，探討羅紅霉素抑制離體哮喘大鼠ASMCs增殖的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 慢性哮喘大鼠ASMCs來自于本實驗室液氮罐中凍存的慢性哮喘大鼠ASMCs細胞株。主要試劑：兔源性caveolin-1多克隆抗體（美國Abcam公司），小鼠源性P21單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），羅紅霉素粉劑（法國Usiphar公司）。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)蘇細胞：取出液氮罐中的凍存管，將其浸入40 ℃的水浴箱中迅速解凍，然后加入5倍體積的RPMI 1640培養(yǎng)基，吹打混勻移入離心管內(nèi)，在離心機內(nèi)1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液輕輕吹打均勻，調(diào)整細胞密度為（1～2）×105/mL接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取3～6代細胞進行實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測ASMCs增殖情況：將哮喘ASMCs單細胞懸液按2×105/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL。隨機分為A組、R10組、R25組、R50組、R100組，并設(shè)立空白組（只含培養(yǎng)基，不含細胞），每組設(shè)6個復(fù)孔。各組首先用含l0%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后用不含血清的RPMI 1640饑餓24 h，使細胞同步于G0期，最后用含不同濃度羅紅霉素（A組：只含0.1% DMSO；R10組：羅紅霉素10 μg/mL+0.1% DMSO；R25組：羅紅霉素25 μg/mL+ 0.1% DMSO；R50組：羅紅霉素50 μg/mL+0.1% DMSO；R100組：羅紅霉素100 μg/mL+0.1% DMSO）的10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，混勻后繼續(xù)置于37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長條件下測定各孔吸光度值。取6個復(fù)孔的平均值作為該組的代表值，重復(fù)5次。計算各組ASMCs增殖活性。細胞增殖活性（%）=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%，As為實驗孔（含培養(yǎng)基、CCK-8、ASMCs、不同濃度羅紅霉素）吸光度值；Ac為對照孔（含培養(yǎng)基、CCK-8、ASMCs）吸光度值；Ab為空白孔（含培養(yǎng)基、CCK-8）吸光度值。

1.2.3 透射電鏡觀察各組ASMCs caveolae變化：取不同濃度羅紅霉素干預(yù)（干預(yù)濃度見1.2.2）的哮喘ASMCs制作電鏡標(biāo)本，透射電鏡下觀察caveolae的變化。

1.2.4 Western Blot法檢測各組caveolin-1、P21的表達變化：提取各組ASMCs蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBST室溫下?lián)u床封閉1 h，TBST洗膜后孵一抗：caveolin-1兔抗大鼠多克隆抗體（1∶1 000）、P21小鼠抗大鼠單克隆抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜。次日洗膜后孵二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 500）或山羊抗小鼠IgG（1∶2 500），室溫下?lián)u床孵育1 h，洗膜后在暗室滴加發(fā)光劑、壓片、顯影、定影。Image Pro Plus6.0軟件分析條帶的光密度（OD）值，將目的條帶OD值與內(nèi)參條帶OD值的比值作為該目的蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析。所得數(shù)據(jù)以±s表示，正態(tài)分布資料的組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗；非正態(tài)分布資料的組間差異比較采用Kruska-Wallis H檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi法檢驗；相關(guān)關(guān)系分析用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測各組細胞增殖情況 CCK-8檢測時，細胞增殖越多越快，顏色越深，所測A值越大。結(jié)果顯示A組吸光度值為0.64±0.13，R10組為0.54±0.13，R25組為0.52±0.12，R50組為0.45± 0.13，R100組為0.38±0.12。由此可見，哮喘ASMCs的增殖隨著羅紅霉素濃度的增高而降低（見圖1）。

2.2 透射電鏡觀察各組ASMCs caveolae變化 透射電鏡下可觀察到A組ASMCs caveolae的表達明顯匱乏，caveolae結(jié)構(gòu)無法辨認。羅紅霉素干預(yù)后哮喘ASMCs caveolae表達增多（見圖2）。

2.3 Western Blot法檢測各組ASMCs caveolin-1、P21的蛋白表達情況 羅紅霉素干預(yù)哮喘ASMCs后，caveolin-1、p21的蛋白表達較A組增高，且隨羅紅霉素濃度的增高而增高，R50組或R100組與A組、R10組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.4 相關(guān)分析結(jié)果 相關(guān)分析示，哮喘ASMCs增殖活性與caveolin-1蛋白表達呈負相關(guān)（r=-0.881，P＜0.05），與P21蛋白表達呈負相關(guān)（r=-0.951，P＜0.05）；caveolin-1蛋白表達與p21蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.957，P＜0.01）。

圖1 羅紅霉素對哮喘ASMCs增殖的影響

圖2 透射電鏡觀察各組ASMCs caveolae變化

表1 各組ASMCs caveolin-1、P21的蛋白表達OD比值（n=4，±s）

表1 各組ASMCs caveolin-1、P21的蛋白表達OD比值（n=4，±s）

與A組比：aP＜0.05；與R10組比：bP＜0.05

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3 討論

羅紅霉素除有抗菌活性外，還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗氧化活性［6］。研究發(fā)現(xiàn)羅紅霉素可通過多種途徑抑制哮喘ASMCs增殖［4-5］。本實驗用不同濃度羅紅霉素干預(yù)離體的哮喘ASMCs，CCK-8試劑盒檢測各組細胞的增殖活性，結(jié)果顯示隨著羅紅霉素干預(yù)濃度增高，各組細胞增殖活性逐漸下降。提示羅紅霉素對離體哮喘ASMCs增殖具有抑制，與體外研究［7］結(jié)果一致，且抑制作用具有濃度依賴性。

caveolae是位于細胞質(zhì)膜的燒瓶樣結(jié)構(gòu)，主要由寡聚化的微囊蛋白、膽固醇和鞘糖脂構(gòu)成，直徑約為50～100 nm。研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)中存在多種信號分子，如P42/P44MAPK、一氧化氮合酶、c-Src等［3，8-9］，故又稱caveolae為細胞的“信號樞紐”。caveolin-1是caveolae的重要功能蛋白，它可以通過內(nèi)部的“鉸手架”區(qū)域與多種信號分子連接并調(diào)控這些信號分子的活性，從而參與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，生長因子受體及下游的信號分子與caveolin-1連接緊密，提示該蛋白參與了細胞的增殖過程［8］。Grossi等［10］研究發(fā)現(xiàn)，caveolin-1可通過負性調(diào)控多胺的吸收而抑制血管平滑肌細胞的增殖；Zeng等［11］發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過上調(diào)caveolin-1的表達而抑制ASMCs的增殖。上述研究提示caveolin-1對平滑肌細胞細胞增殖有負性調(diào)控作用。筆者前期的在體研究［7］也證實：與正常組相比，哮喘組大鼠氣道平滑肌層明顯增厚，而caveolin-1表達下降，相關(guān)分析示氣道平滑肌厚度與caveolin-1的表達呈顯著負相關(guān)。本離體實驗結(jié)果顯示，哮喘組caveolae結(jié)構(gòu)匱乏，羅紅霉素干預(yù)后caveolae結(jié)構(gòu)有逐漸增多趨勢，caveolin-1的表達亦逐漸增加，而ASMCs的增殖活性逐漸下降，相關(guān)關(guān)系分析示哮喘ASMCs增殖活性與caveolin-1蛋白表達呈負相關(guān)，提示羅紅霉素抑制離體哮喘ASMCs增殖的作用與其上調(diào)caveolae/caveolin-1的表達有關(guān)。

真核細胞的增殖需通過有絲分裂完成，在整個細胞周期中G1期/S期是細胞有絲分裂的“限制點”，是細胞增殖周期的關(guān)鍵。P21Waf1/Cip1是細胞周期重要的負性調(diào)節(jié)因子，屬于細胞周期素依賴性激酶抑制劑（CDK inhibitor，CKI）家族。在哺乳動物中，P21蛋白可與細胞周期素、CDK組成復(fù)合體，調(diào)控細胞從G1期到S期的過渡；除此之外，P21蛋白還可以通過與DNA合成所必需的增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）結(jié)合，抑制DNA的合成與復(fù)制［12-13］。故P21可通過上述雙重作用調(diào)控細胞周期“限制點”。有研究發(fā)現(xiàn)，P21與血管平滑肌細胞增殖密切相關(guān)［14-15］；Zhang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠間充質(zhì)細胞過度表達caveolin-1可導(dǎo)致P53、P21的表達增加。本離體實驗結(jié)果顯示，隨羅紅霉素干預(yù)濃度的升高，哮喘ASMCs增殖活性逐漸下降，P21的表達逐漸增加，相關(guān)關(guān)系分析示P21蛋白表達與哮喘ASMCs增殖活性呈負相關(guān)，與caveolin-1蛋白表達呈正相關(guān)。提示羅紅霉素可能通過通過上調(diào)caveolae/caveolin-1的表達，引起P21蛋白表達增加，從而抑制離體哮喘ASMCs的增殖。但caveolin-1與P21之間的相互作用機制仍需要進一步研究。

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（本文編輯：丁敏嬌）

The role of caveolin-1 and P21 in the process of roxithromycin to inhibit the proliferation of asthmatic rats ASMCs in vitro

WANG Ruili1， DAI Wei1， DAI Yuanrong2. 1.Department of Critical Care， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.Department of Respiratory Medicine， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Objective: To explore the role of caveolae/caveolin-1 and P21 in the process of roxithromycin to inhibit the proliferation of asthmatic rats ASMCs in vitro. Methods: Recovery freeze-stored ASMCs of asthmatic rats were divided into five groups ［group A （blank group）， group R10 （roxithromycin 10 μg/mL）， group R25 （roxithromycin 25 μg/mL）， group R50 （roxithromycin 50 μg/mL） and group R100 （roxithromycin 100 μg/ mL）］. The proliferation of ASMCs induced by roxithromycin were tested by CCK-8. The changes of caveolae in ASMCs were observed by transmission electron microscope. The protein expressions of caveolin-1 and P21 were measured by Western blot. Results: Roxithromycin could inhibit the proliferation of asthmatic rats ASMCs in vitro and had concentration-dependent manner. With the increased of intervention concentration， the expression of caveolae increased and the protein expressions of caveolin-1， P21 increased. Besides， compared with group A or group R10， the expressions of caveolin-1 and P21 protein in group R50 or R100 showed significantly different （P＜0.05）. There was significantly negative correlation between the cell activity rate of asthmatic rats and the expressions of caveolin-1 and P21 protein （r=-0.881， r=-0.951， P＜0.05）. The expression caveolin-1 was positively correlated with P21 （r=0.957， P＜0.01）. Conclusion: Roxithromycin inhibits the proliferation of ASMCs from asthmatic rats in vitro may partly through promoting the expression of P21 protein which induced by increased the expression of caveolae/ caveolin-1.

asthma； airway smooth muscle cells； caveolae； caveolin-1； p21； roxithromycin

R56

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.09.002

2015-10-23

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY16H010007）。

王瑞麗（1987-），女，山西長治人，住院醫(yī)師，碩士。

戴元榮，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：dai yr@126.com。