楊歡　丁月珠　段天璇

摘要：目的 建立柱前衍生HPLC-UV法測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸含量的方法。方法 以2-萘基溴甲基酮為衍生試劑、三乙胺為催化劑、60 ℃水浴條件下對(duì)豬去氧膽酸進(jìn)行衍生，采用HPLC-UV法測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸含量。結(jié)果 當(dāng)衍生試劑與豬去氧膽酸的摩爾比>20∶1，催化劑與豬去氧膽酸的摩爾比>15∶1，在60 ℃水浴條件下反應(yīng)50 min時(shí)，衍生反應(yīng)完全。豬去氧膽酸在0.1～2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 7），平均回收率為97.85%（RSD=1.6%）。人工牛黃樣品中豬去氧膽酸的含量為4.12%。結(jié)論 本方法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可用于測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸的含量。

關(guān)鍵詞：人工牛黃；豬去氧膽酸；柱前衍生；高效液相色譜法；紫外檢測(cè)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.021

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）10-0092-03

Abstract： Objective To establish a pre-column derivation HPLC-UV method for the content determination of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis. Methods The hyodeoxycholic acid was derived by 2-bromo-2-acetonaphthoneat using triethylamine as the catalyst in 60 ℃ water bath. After that， a HPLC-UV method was established to determine the content of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis. Results When the derivatising time at 60 ℃ water bath was 50 min， the radio of the molar amount of derived reagents and hyodeoxycholic was over 20：1 and the radio of catalyst and hyodeoxycholic was over 15：1； the reaction was completed. The calibration curve was linear within the range of 0.1–2 μg for hyodeoxycholic acid （r=0.999 7）， and the average recovery was 97.85% （RSD=1.6%）. In this sample， the content of hyodeoxycholic is 4.12%. Conclusion The method is with high sensitivity， highly reproducible， reliable and accurate for the content determination of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis.

Key words： artificial calculus bovis； hyodeoxycholic acid； pre-column derivation； HPLC； UV

人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成，是天然牛黃的代用品之一[1]，其在中藥制劑中的使用可有效緩解天然牛黃資源短缺。豬去氧膽酸為人工牛黃的特征成分之一，測(cè)定其含量可在一定程度上控制人工牛黃的質(zhì)量，同時(shí)豬去氧膽酸也是區(qū)別人工牛黃和天然牛黃的指標(biāo)性成分。由于豬去氧膽酸為末端吸收，無(wú)法采用高效液相紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。目前多采用高效液相蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[2-3]和薄層掃描法[4]測(cè)定其含量，但靈敏度較低。雖然采用質(zhì)譜法測(cè)定有非常高的靈敏度，但存在儀器價(jià)格昂貴、重復(fù)性差等缺點(diǎn)。采用柱前衍生HPLC-UV法可以提高靈敏度，同時(shí)普適性強(qiáng)。故本試驗(yàn)采用柱前衍生后高效液相紫外檢測(cè)器檢測(cè)，對(duì)人工牛黃中豬去氧膽酸的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（LC-20AT），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器有限公司），電子天平（CPA225D，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MTN-2800D型氮?dú)獯蹈蓛x（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）

豬去氧膽酸對(duì)照品（純度98%，成都曼斯特生物科技有限公司，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)MUST-15032804），人工牛黃（產(chǎn)地安徽，批號(hào)20110116，購(gòu)自北京同仁堂），三乙胺（純度為99.0%，天津市福晨化學(xué)試劑廠），2-萘基溴甲基酮（純度98%，上海晶純生化科技股份有限公司），水為去離子水，甲醇、乙腈均為色譜純。其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%磷酸（83∶17，V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取豬去氧膽酸對(duì)照品1 mg置1mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度。

2.2.2 人工牛黃提取液 精密稱取人工牛黃20 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，稱定質(zhì)量，超聲30 min（功率300 W，工作頻率40 kHz），冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，即得。

2.2.3 衍生試劑溶液 精密稱取2-萘基溴甲基酮63.5 mg于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

2.2.4 催化劑溶液 取三乙胺35.5 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

2.3 衍生化反應(yīng)

取人工牛黃提取液，定容于1 mL容量瓶中，氮?dú)獯蹈?。加入催化劑溶?.1 mL、衍生試劑溶液0.75 mL，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取催化劑溶液0.1 mL、衍生試劑溶液0.75 mL于1 mL容量瓶中后用甲醇定容到刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖與人工牛黃衍生化反應(yīng)后的色譜圖進(jìn)行對(duì)比，見圖1、圖2。衍生試劑及催化劑對(duì)衍生產(chǎn)物無(wú)干擾，專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.005、0.01、0.02、0.05、0.07、0.1 mL于1 mL容量瓶中。按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物峰面積。以峰面積對(duì)豬去氧膽酸質(zhì)量作圖，結(jié)果豬去氧膽酸在0.1～2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.0×108X-9551 9，r=0.999 7。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 將人工牛黃提取液按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD=2.7%。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照人工牛黃提取液的提取方法制備6份提取液，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，RSD=2.3%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將人工牛黃提取液分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄產(chǎn)物峰面積，RSD=2.4%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取人工牛黃約10 mg，按人工牛黃提取液的方法提取6份提取液，取提取液定容于1mL容量瓶中，氮?dú)獯蹈伞７謩e加入豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液33、33、41、41、49、49 μL后按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.5 樣品含量測(cè)定

取人工牛黃樣品，按上述提取方法和衍生條件反應(yīng)后，測(cè)定豬去氧膽酸衍生產(chǎn)物峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算豬去氧膽酸含量，結(jié)果表明樣品中豬去氧膽酸的含量為4.12%。

3 討論

3.1 衍生反應(yīng)條件的確定

3.1.1 衍生時(shí)間 取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中，加催化劑溶液0.1 mL、衍生試劑溶液0.5 mL，用甲醇定容至刻度，平行操作7份，分別于60 ℃水浴中反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖3。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨反應(yīng)時(shí)間而增大，反應(yīng)50 min時(shí)達(dá)到最大。

3.1.2 催化劑用量 取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中，加入衍生試劑溶液0.5 mL后分別加入2～30倍反應(yīng)物摩爾量的催化劑溶液，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖4。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨加入催化劑溶液的增大而增大，當(dāng)催化劑的摩爾量為反應(yīng)物的10倍后反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積沒有明顯增加。

3.1.3 衍生試劑用量 取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中，加催化劑溶液0.05 mL后分別加入2～100倍反應(yīng)物摩爾量的衍生試劑溶液，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖5。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨加入衍生試劑溶液的增大而增大，當(dāng)催化劑的摩爾量為反應(yīng)物的20倍后反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積沒有明顯增加。

3.2 高效液相色譜條件確定

衍生化反應(yīng)后，將衍生產(chǎn)物在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)紫外掃描，其最大吸收波長(zhǎng)為238 nm，故選擇238 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。采用甲醇和1%磷酸溶液為流動(dòng)相，衍生產(chǎn)物的峰形較好。同時(shí)，流動(dòng)相的用量比為甲醇-1%磷酸（83∶17，V∶V）、流速為1.0 mL/min時(shí)，可以使衍生產(chǎn)物與雜質(zhì)峰獲得最佳分離。

4 小結(jié)

采用本法測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸含量的結(jié)果與其他方法[4-5]相差不大。與其他文獻(xiàn)報(bào)道的衍生方法[6-7]相比，本法以價(jià)格低廉的溴乙?；噭檠苌噭?、三乙胺為催化劑，提供堿性環(huán)境，降低了衍生反應(yīng)的成本。本試驗(yàn)考察了衍生試劑用量、催化劑用量、反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生產(chǎn)物的影響，確定了衍生反應(yīng)進(jìn)行完全所需的條件。整個(gè)衍生反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成，利用HPLC-UV法對(duì)其進(jìn)行分離，可在15 min內(nèi)完成；方法學(xué)考察結(jié)果顯示本法穩(wěn)定可靠，可作為人工牛黃中豬去氧膽酸的含量測(cè)定的方法。本研究可為其他甾體類等無(wú)紫外吸收物質(zhì)的分析提供依據(jù)，是一種靈敏度高、價(jià)格低廉、重復(fù)性好、快速簡(jiǎn)便的分析方法。

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（收稿日期：2015-11-07；編輯：陳靜）