李曉燕，魏濱，朱美冬，羅運權，王文海，蘇式兵

1.上海中醫(yī)藥大學復雜系統(tǒng)研究中心，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝膽外科，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200137

生命科學前沿技術在病證結合研究中的應用

李曉燕1，魏濱1，朱美冬2，羅運權2，王文海3，蘇式兵1

1.上海中醫(yī)藥大學復雜系統(tǒng)研究中心，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝膽外科，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200137

病證結合研究是目前中西醫(yī)結合研究的主要思路與方法。病證結合體現(xiàn)了中西醫(yī)2種醫(yī)學的優(yōu)勢互補，通過多學科交叉探討病證之間的關系，研究疾病證候診斷及辨證施治規(guī)律等。得益于現(xiàn)代生命科學技術的發(fā)展，病證結合研究取得了長足的進步。本文主要介紹了近年來數(shù)據挖掘技術、系統(tǒng)生物學技術、表觀遺傳學技術、網絡生物學技術在病證結合研究中的應用和發(fā)展前景，為進一步研究和臨床應用提供思路和方法。

病證結合；中西醫(yī)結合；技術應用；綜述

中醫(yī)的“證”是對機體在疾病發(fā)展中某一階段的病理概括，而西醫(yī)所診斷的“病”是指人體在受到致病因素作用后，在體內出現(xiàn)的具有一定發(fā)展規(guī)律的病理演變全過程，二者相互交叉，同一疾病在不同發(fā)展階段會出現(xiàn)不同證候，同一證候又會出現(xiàn)在不同疾病中。病證結合研究是把中醫(yī)的證放在疾病背景下研究，是多種理論的相結合及囊括多種診療措施的現(xiàn)代病證結合的新模式，對提高臨床診療水平具有重要意義。

病證結合研究的關鍵任務是解決證候分類的客觀化、證候的分子生物學基礎及證候的發(fā)生演變的內在機制等問題。近年來病證結合研究取得較大進展，這與生命科學技術及分析技術的發(fā)展是同步的。這些新技術主要包括數(shù)據挖掘技術、系統(tǒng)生物學技術、表觀遺傳學技術及生物網絡技術等。茲就相關技術在病證結合研究領域的應用作一綜述。

1　數(shù)據挖掘技術

數(shù)據挖掘是利用統(tǒng)計分析和人工智能等新技術以分析數(shù)據庫中的數(shù)據，尋找其規(guī)律性，提取出事先未知而潛在有用的信息。其代表方法有多元統(tǒng)計、聚類分析、關聯(lián)分析、決策樹、神經網絡、貝葉斯網絡和潛在結構模型等。因傳統(tǒng)中醫(yī)證候診斷主觀性強，病證原始數(shù)據的獲得過程中可能混雜不規(guī)范數(shù)據或噪聲數(shù)據，導致眾多臨床資料中隱藏著大量的信息［1］，其辨證過程也缺乏客觀的衡量依據，不能為科學實驗提供客觀診斷［2］。數(shù)據挖掘技術以其善于處理非線性復雜數(shù)據、挖掘數(shù)據內在規(guī)律而在中醫(yī)證候研究中受到廣泛的關注，在中醫(yī)證候模型的建立方面具有一定的優(yōu)勢［3］。

有研究者運用數(shù)據包絡分析法對中醫(yī)證候進行“序列化”，拋棄以往對證候數(shù)據的無序挖掘，利用證候的發(fā)生、演變、轉歸等規(guī)律進行建模［4］。隱結構模型可通過客觀資料的分析，揭示證候發(fā)生與共生的規(guī)則，獲得復雜分類標準。而在具有先驗知識的前提下，貝葉斯網絡進行證候分類的正確率較高。關聯(lián)規(guī)則算法在對數(shù)據進行分析，從中找到證候元素對證型判別的貢獻權重，形成“證候元素-證型”診斷量表［5-7］。而且，中醫(yī)“病證結合”的研究應重視以“證”為研究單位，引進微觀辨證的研究成果，綜合運用不同的智能算法進行數(shù)據挖掘，才能達到最佳的證候診斷效果。

2　系統(tǒng)生物學技術

系統(tǒng)生物學是以系統(tǒng)理論為指導，研究一個生物系統(tǒng)中所有組成成分（基因、蛋白質等）的構成，以及在特定條件下這些組分間相互關系的科學。系統(tǒng)生物學的“涌現(xiàn)”特性與中醫(yī)的整體觀異曲同工，利用組學技術檢測機體的生物學物質基礎，進而整合這些生物信息，進而探索和闡明機體物質組學的整體變化，這為病證結合研究提供了新的研究思路［8］。系統(tǒng)生物學技術主要包括基因組學技術、轉錄組學技術、蛋白質組學技術以及代謝組學技術等，將這些組學技術運用到病證結合研究中，得到病證相關指紋圖譜，獲取證候相關生物標志物，極大地推進了病證結合研究的進展。

2.1基因組學/轉錄組學技術

基因組學技術主要是對生物體內所有基因進行繪圖、核苷酸序列分析及基因功能分析，研究基因組的表達、基因的多樣性、基因組功能的闡釋及蛋白質產物的功能等的技術。包括基因芯片、測序等各種高通量技術以及實時熒光 PCR等定量分析技術。轉錄組學是功能基因組學的重要組成部分，是在整體水平上研究基因全部轉錄本種類、結構和功能及轉錄調控規(guī)律的學科。

證候作為機體對致病因素的反應，不僅與致病因素的性質和強弱有關，更與患者個體的體質因素有關，而基因組學認為基因序列的多態(tài)性及基因表達的差異又決定了個體差異，可以認為基因及其表達的改變是證的“內涵”。所以，運用基因芯片、測序等技術以發(fā)現(xiàn)不同證候基因序列的多態(tài)性及表達譜之間的差異，從而確定證候相關基因，有助于證候精確診斷［9］。迄今的研究顯示病證的基因組學研究主要包含2個層次，即證候的單核苷酸多態(tài)性研究和證候的基因表達譜研究。

2.1.1證候基因多態(tài)性研究二代測序或大規(guī)模并行測序的出現(xiàn)，將各種分析和篩選輕松升級。技術革新使測序數(shù)據的數(shù)量和質量不斷攀升。運用基因測序技術，檢測不同證候患者基因序列，通過比較得出疾病相關基因多態(tài)性與證候之間的聯(lián)系，有利于中醫(yī)證候分型研究［10］。Zhou等［11］利用Affymetrix SNP芯片對12個腎陽虛及3個非腎陽虛患者進行單核甘酸多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)腎陽虛證有5處（包括DCDC5基因）發(fā)生連鎖失衡單核苷酸多態(tài)性變化，并證實 DCDC5基因及其旁邊其他基因單核甘酸多態(tài)性與腎陽虛證有關。Li等［12］利用SNaP shot Assay研究扶正化瘀方對乙型肝炎肝硬化患者CYP1A2基因多態(tài)性的影響，結果表明扶正化瘀方對乙肝肝硬化證候組的作用與CYP1A2-G2964A位點基因多態(tài)性有關。

目前三代測序技術（即單分子測序技術）逐漸發(fā)展起來，與二代測序技術相比，單分子測序技術具有更加快速、簡便、讀長更長、分辨率也更高的特點，且單分子測序技術可直接對RNA進行測序，即檢測細胞和組織內基因表達水平，同時對基因的結構做出分析，這會大大促進對病證基因表達譜的研究。另外，三代測序技術可檢測出基因的甲基化，為病證的表觀遺傳調控的研究打開了一條通路［13］。

2.1.2證候的基因表達譜研究基因表達譜芯片是基因芯片中的一個重要分支，主要側重于研究轉錄水平上基因的變化，用于闡明在疾病、藥物或其他因素的干擾下，基因的表達差異情況。利用基因表達譜芯片技術，研究者可對不同狀態(tài)的組織細胞內基因表達情況進行對比分析，進一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互為因果等關系，并能通過分析比較這些差異表達基因，進而逐步識別決定證本質的關鍵基因，在基因表達的基礎上闡明證候的發(fā)生、演變機制［14］。有研究運用基因表達譜芯片技術檢測乙肝和肝硬化患者不同證候的差異基因表達譜，找出差異基因，獲得顯著成果，從分子層面上為中醫(yī)“異病同證”“同病異證”的客觀化提供依據［15-17］。筆者認為，運用基因表達譜芯片檢測病證相關的差異表達基因，能在一定程度上揭示病證生物物質基礎及其分子機制。

2.2蛋白組學技術

蛋白質組學技術是以蛋白質組為研究對象，分析細胞內蛋白質的組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)的動態(tài)變化，了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質組成與調控的活動規(guī)律的技術。蛋白質組學動態(tài)、宏觀、整體和綜合特點與中醫(yī)證候具有的波動性、整體性、時序性、可預測性和標志性極其相似，有利于動態(tài)的揭示同一個研究對象不同時期的變動性，更符合病證的特點［18］。常用的蛋白組學技術包括二位凝膠電泳技術、多位液相色譜技術、質譜技術及蛋白芯片技術等。

運用蛋白質組學技術對同病異證或異病同證患者的組織和細胞蛋白質進行分析研究，可揭示疾病發(fā)生發(fā)展變化過程中蛋白質的差異表達。因此，蛋白質組學技術能夠成為揭示中醫(yī)證候變化以及藥物作用靶點物質和功能基礎的重要手段，并且在此基礎上可以建立疾病證候的蛋白質數(shù)據庫［19］。

有研究者對子宮內膜異位癥（EMT）不同證候患者增生期在位和異位內膜組織和增生期正常子宮內膜組織標本提取組織總蛋白，并通過雙向電泳技術輔助激光解吸電離飛行時間質譜及蛋白質數(shù)據庫檢索進行蛋白質鑒定。結果顯示EMT不同證候之間蛋白質組成分存在差異。推測這些差異可能是證候實質的內在根源，可能成為EMT不同證候發(fā)病的候選生物標志物［20］。Song等［21］運用SELDI蛋白芯片檢測慢乙肝虛證和實證患者的血清蛋白，并進行復雜分析，結果發(fā)現(xiàn)2種血清蛋白可作為慢乙肝虛證和實證的分類依據。因此，蛋白組學研究可能為病證結合診斷提供生物標志物，輔助臨床診斷，能明顯提高診斷的準確性，進而提高對證治療效果。

2.3代謝組學技術

代謝組學技術是通過考察生物體系受刺激或擾動后（如將某個特異的基因或環(huán)境變化后）代謝產物的變化或其隨時間的變化，研究生物體系的代謝途徑的一種技術。常用的代謝組學技術包括核磁共振技術、氣相色譜質譜聯(lián)用技術、液相色譜質譜聯(lián)用技術等?；诖x組學可以觀測生物體受到擾動后（外界刺激、環(huán)境變化或遺傳修飾）所有代謝應答的全貌和動態(tài)變化，與中醫(yī)辨證論治的整體觀和動態(tài)連續(xù)性相契合，代謝組學更有利于動態(tài)揭示證候發(fā)生演變規(guī)律。運用代謝組學技術在病證結合臨床研究中有助于早期發(fā)現(xiàn)疾病證候生物標志物而達到輔助臨床診斷的目的［22-23］。該技術能通過檢測不同時間點患者的代謝組，對由疾病及對證治療引起的代謝產物的動態(tài)變化進行分析［24］。

3　表觀遺傳學技術

表觀遺傳調控是指不改變基因DNA序列，而通過某種機制改變基因座或染色體狀態(tài)，并進一步影響表型的調節(jié)方式。表觀遺傳調控是復雜疾病證候本質的重要內容，是遺傳與環(huán)境共同作用的結果，對同病異證、異病同證進行表觀遺傳調控研究或許是揭示證候本質的一種途徑，表觀遺傳調控的可逆性也是中醫(yī)通過綜合方式調控的重要環(huán)節(jié)［25-26］。表觀遺傳學調控包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNAi、染色體重塑、基因組印跡、microRNA調控等在內的多種修飾機制。劉氏［27］采用甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測急性髓系白血病和健康人ID4基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)并進行組間及中醫(yī)證型間比較，結果顯示ID4基因啟動子區(qū)甲基化陽性表達與證候相關。由于表觀遺傳是可逆性的，因此，筆者認為消除表觀調控對基因的影響是中醫(yī)調治復雜性疾病證候的重要環(huán)節(jié)。

microRNA（miR）是一類非編碼的單鏈小分子RNA，通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉錄后水平調控基因表達。研究表明，miR可通過調控組蛋白修飾引起染色質重塑，導致基因表達異常［28］。Gao等［29］發(fā)現(xiàn)，miR-17、miR-21、miR-181b和miR-196a可作為胰腺癌辨證依據。Zhang等［30］發(fā)現(xiàn)，血清miR-583和miR-663或許可作為區(qū)分乙肝肝膽濕熱證和肝腎陰虛證的標志物。雖然尚無miR調控表觀遺傳的病證結合方面的研究，但筆者認為這將成為揭示環(huán)境對證候影響的中醫(yī)理論分子內涵的重要途經。

4　網絡生物學技術

網絡生物學技術是利用生物網絡（包括基因調控網絡、蛋白交互網絡、代謝和信號轉導網絡等）描述研究對象的生物學性質、分析因果關系、認識生命活動規(guī)律的一門技術。人是生物分子相互作用形成的復雜網絡，病證的發(fā)生發(fā)展是這個復雜網絡失衡導致的，單一分子及其構成的單一信號轉導通路難以反映病證機制和治療的關鍵，因此需要從整體聯(lián)系的角度，整合不同層次的信息達到對病證機制的整體理解和認知。而生物分子網絡則是該研究策略下的重要切入點［31］。所以，把網絡生物學技術運用到病證結合研究中，有助于從分子水平綜合描述病證發(fā)展過程的復雜性及其相互之間的關聯(lián)關系，以及尋找辨證選方的中藥方劑作用的靶標。

4.1基于生物分子網絡的“病-證”關系研究

生物分子網絡主要是指基因、基因產物和代謝物等生物分子之間通過復雜相互作用而形成的網絡，也可拓展到以生物分子為基礎的信號通路網絡、代謝網絡、生物過程網絡、組織網絡等。而融合文獻挖掘與基因表達譜分析、構建特定“病-證”生物分子網絡是用于分析同病異證、異病同證分子基礎的前提條件。研究顯示，將分子生物網絡運用到病證結合研究，不僅能進一步理解寒熱、血瘀等不同證候之間的關系，還可從分子層面對疾病“辨證論治”及藥物與疾病之間“同病異治”“異病同治”的研究提供實驗依據［32］。Lu等［33］將“病-證”的關系置于生物分子網絡的背景下進行比較分析，探討了慢性乙型肝炎和肝硬化“同病異證”“異病同證”的分子機制。

4.2基于網絡藥理學的辨證論治研究

網絡藥理學是建立在疾病-基因-藥物的多層次網絡基礎上，從整體上預測藥物靶點、提高藥物發(fā)現(xiàn)效率的新興學科［34］。辨證施治是中醫(yī)治療學的精華，也是中醫(yī)藥個性化治療的主要表現(xiàn)。運用網絡藥理學方法研究病-證-方對應關系，可以揭示疾病、證候、方藥之間的內在聯(lián)系及網絡調控機理，從而更深入把握辨證論治的精髓。有研究通過IPA軟件分別構建類風濕關節(jié)炎（RA）熱證和對證中藥靶蛋白的分子相互作用網絡，結果顯示，RA熱證的疾病狀態(tài)和對證中藥的干預靶點，都能作用在相同的細胞信號轉導通路，干預通路中的相同或不同的關鍵分子，進而影響整個通路的生物學功能。這也許就是對證中藥治療RA熱證“藥-證對應”的分子生物學機制之一。

網絡生物學的方法應用于中醫(yī)證候及中藥復方的研究，對科學、合理的解釋中醫(yī)證候特征、證候病機演變內涵及病-證-方的相關性等中醫(yī)學最根本問題甚有裨益；另外，還可用于觀察中藥干預前后患者代謝網絡的整體變化及動態(tài)趨勢，分析干預前后生物網絡的變化，探明中藥復方干預該病證在代謝網絡層面上的功能模塊和生物靶點，從而提供研究中藥復方作用機制的新思路。

5　展望

開展中西醫(yī)生物醫(yī)學信息學研究，分析與挖掘病證組學數(shù)據，并進行“病-證-方/效”生物網絡的構建與分析，從而為臨床診斷和治療提供決策支持，是開展病證結合研究的主要思路。盡管上述新技術為病證結合研究提供了不少支持并取得一定成果，但尚有許多問題有待改進，如數(shù)據挖掘僅用于證候診斷量表及診斷模型的建立，且處于探索階段，并不能真正代替醫(yī)生診斷。因此，還需在建立完整的四診數(shù)據庫基礎上開發(fā)真正的人工智能診斷系統(tǒng)。另外，利用系統(tǒng)生物學技術獲得病證動態(tài)變化信息雖然反映了機體內的動態(tài)變化，但因沒有確切的診斷標準，故這種標志物指向相對的，尚不能實際用于臨床診斷。如何確立統(tǒng)一標準，從而為診斷治療及療效判定提供一個確切的標準是今后的研究重點。

針對病證結合研究不斷積累的大量數(shù)據，開展基于系統(tǒng)生物學、生物信息學及復雜科學等多學科交叉的病證分子診斷及其調控機制研究，能為具有整體思維和個體化特征的中醫(yī)臨床證候的精確診斷和治療提供依據，促進中西醫(yī)結合學科及中西醫(yī)結合臨床精確醫(yī)療的發(fā)展，推動中醫(yī)藥大健康發(fā)展及個體化精確醫(yī)療科學前沿研究。即以個人基因組信息為基礎，結合蛋白質組、代謝組及表型組等相關內環(huán)境信息，為患者量身設計出最佳診療方案，以期達到治療效果最大化和不良反應最小化的一門定制醫(yī)療模式。因此，利用新技術開展中西醫(yī)病證結合研究將為個體化精確醫(yī)療作出巨大貢獻。

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Application of Cutting-edge Techniques of Life Science in Research on Disease-Syndrome Combination

LI Xiao-yan1， WEI Bin1， ZHU Mei-dong2， LUO Yun-quan2， WANG Wen-hai3， SU Shi-bing1
（1. Research Center for Traditional Chinese Medicine Complexity System， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2. Department of Liver and Gallbladder Surgery， Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 3. Department of Oncology， Shanghai Seventh People Hospital， Shanghai 200137， China）

Research on disease-syndrome combination is the main approach and method of research on integrative traditional Chinese and Western medicine. Disease-syndrome combination embodies the complementary advantages of traditional Chinese medicine and Western medicine. It discusses the relationship between diseases and syndromes through an interdisciplinary approach， and explores rules of disease diagnosis and treatment based on differential diagnosis. Thanks to the development of modern life science techniques， research on disease-syndrome combination has made great achievements. This article mainly introduced the application and the development prospects of new techniques， such as data mining， system biology， epigenetics， biological network and network pharmacology in the research on disease-syndrome combination in recent years， with a purpose to provide the ideas and the methods for further research and clinical application.

disease-syndrome combination； integrative traditional Chinese and Western medicine； technique application； review

R2-05

A

1005-5304（2016）10-0132-05

2015-08-10）

（

2015-10-09；編輯：梅智勝）

國家自然科學基金（81202667）；上海市中醫(yī)臨床重點學科建設項目（ZYXK202010）；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學科群建設項目（PWZxq2014-12）

蘇式兵，E-mail：shibingsu07@163.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.033