林玲輝 王卓 李迎娟 胡亞平

（邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微生物與免疫教研室 河北邢臺(tái) 054300）

殼聚糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的保護(hù)作用

林玲輝 王卓 李迎娟 胡亞平

（邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微生物與免疫教研室 河北邢臺(tái) 054300）

目的：研究殼聚糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：C57BL/6雌性小鼠60只，隨機(jī)分為4組，空白組（n=12）、模型組（n=12）、陰性對(duì)照組（n=12）、給藥組（n=12）。模型組和給藥組腹腔注射LPS復(fù)制小鼠肺損傷模型，給藥組同時(shí)注射殼聚糖，空白組和陰性對(duì)照組注射等量的生理鹽水和殼聚糖溶液。注射LPS 24h后處死小鼠，取血，分離血清，并收集支氣管肺泡灌洗液，剖取肺組織。測(cè)定肺組織濕干重比，氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）含量，炎癥因子TNF-α、IL-6水平。結(jié)果：顯著抑制ALI小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，脂質(zhì)過(guò)氧化生物標(biāo)記物MDA含量和超氧化物歧化酶減少。IL-6和TNF-α水平下降。結(jié)論：殼聚糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有一定保護(hù)作用，顯示出良好的抗炎效應(yīng)，作用機(jī)制與抗氧化、抑制炎性細(xì)胞因子的釋放有關(guān)。

丙二醛 髓過(guò)氧化物酶 炎癥因子

急性肺損傷（Acute Lung Injury,ALI）是由如嚴(yán)重感染、多創(chuàng)傷、休克等多種內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的多器官功能障礙綜合征。ALI的發(fā)病率隨病因不同而不同,其中最常見(jiàn)的為細(xì)菌感染誘發(fā)的膿毒血癥。ALI若早期得不到及時(shí)治療,可發(fā)展成嚴(yán)重階段的急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）。本研究通過(guò)建立小鼠ALI模型,觀察低分子殼聚糖對(duì)ALI的保護(hù)作用,分析氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）含量變化及TNF-a、白細(xì)胞介素（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)變化,從而為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1.1 試劑與動(dòng)物

主要實(shí)驗(yàn)試劑：LMCTS（Mr=5000）購(gòu)于濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；內(nèi)毒素（L2880 型）購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司；小鼠TNF-a、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司,等。

1.2 方法

LPS誘導(dǎo)動(dòng)物ALI模型的建立 實(shí)驗(yàn)小鼠60只（邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）：按體重隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、急性肺損傷（ALI）模型組、殼聚糖組（5 mg/kg）以及殼聚糖+LPS組,每組10只。殼聚糖組和殼聚糖+LPS組每天給予（5 mg/kg）劑量的殼聚糖,其他組均給予等量的生理鹽水,連續(xù)灌胃10 d,10 d后,ALI模型組、模型組和殼聚糖+LPS組小鼠分別腹腔注射細(xì)菌脂多糖（LPS）6.0 mg/kg,建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ALI模型,正常對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水。造模6 h后處死小鼠并取肺組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 肺組織濕干重比（W/D）檢測(cè)

留取新鮮右肺第二葉,濾紙吸干表面附著水分及血漬后,用分析天平稱重,為濕重,并記錄。至70℃恒溫箱48h于恒重后稱重,為干重,并記錄。計(jì)算肺組織濕干重比（W/D）比值。

1 材料與方法

1.4 小鼠肺組織抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

取各組小鼠肺組織100mg進(jìn)行勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清,

測(cè)定各組髓過(guò)氧化物酶（MPO）、和丙二醛（MDA）水平。MPO 和MDA活性測(cè)定采用R&D公司的ELISA試劑盒；

1.5 小鼠肺組織炎癥因子檢測(cè)

取各組小鼠肺組織100mg進(jìn)行勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清,采用采用R&D公司的ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α和IL-6水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 低分子殼聚糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺組織內(nèi)IL-6和TNF-α含量的影響

圖1 低分子殼聚糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺組織濕干重比（W/D）的影響

圖2 低分子殼聚糖抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺組織急性氧化應(yīng)激反應(yīng)

2 結(jié)果

2.1 肺組織濕干重比（W/D）結(jié)果

經(jīng) 48 h 烘箱以至恒重之后,分別計(jì)算四組小鼠鼠肺組織 W/ D 值。以Control組為對(duì)照,LPS 組肺組織 W/D 比值較 Control組顯著增大（P ＜0.01）；殼聚糖組與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。給藥組與 LPS 組相比,W/D 比值有所下降（P ＜0. 05）,在一定程度上,說(shuō)明殼聚糖對(duì)脂多糖引起的滲透性肺水腫有減輕作用,減少炎細(xì)胞的滲出,對(duì)炎癥反應(yīng)有一定的抵抗作用。

2.2 肺組織勻漿

MDA和MPO含量測(cè)定 由圖2可見(jiàn),LPS處理的小鼠肺組織內(nèi)MDA和MPO含量高于空白對(duì)照組（P ＜0.01）,說(shuō)明LPS導(dǎo)致小鼠肺組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。與對(duì)照組相比,殼聚糖處理對(duì)肺組織內(nèi)MDA和MPO含量沒(méi)有顯著影響,但可明顯抑制LPS所致的MDA和MPO含量增多（P ＜0.01）。結(jié)果表明殼聚糖可以抑制LPS誘導(dǎo)的肺組織急性氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.3 肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-a和IL-6表達(dá)量的測(cè)定

由表1可見(jiàn)：LPS處理的小鼠肺組織內(nèi)TNF-α和IL-6與空白對(duì)照組比較,ALI模型組小鼠肺組織TNF-α和IL-6含量顯著升高（P＜0.01）,與空白對(duì)照組比較,殼聚糖處理對(duì)肺組織內(nèi)TNF-α和IL-6沒(méi)有顯著影響,但可明顯抑制LPS所致的TNF-α和IL-6含量增多（P＜0.01）。結(jié)果表明殼聚糖可以抑制LPS誘導(dǎo)的肺組織炎癥因子的釋放。

3 討論

ALI是呼吸系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的疾病之一,常繼發(fā)于感染、休克、外傷等重癥過(guò)程。臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫,頑固性低氧血癥等［1］。LMCTS是一種天然的帶正電荷的高分子化合物。據(jù)報(bào)道,殼聚糖對(duì)球囊損傷大鼠腹主動(dòng)脈再狹窄具有保護(hù)作用,且一定分子量的殼聚糖也可在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞和血管成纖維細(xì)胞的增殖［2］。為了探討LMCTS對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)采用肺損傷動(dòng)物模型觀察了LMCTS的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與ALI模型組比較,LMCTS可降低MDA和MPO含量,抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌。說(shuō)明LMCTS可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的釋放以及拮抗氧應(yīng)激反應(yīng),起到一定的肺保護(hù)作用。

綜上所述,LMCTS能降低由于LPS誘發(fā)的肺組織W/D、TNF-α、IL-6、MDA和MPO,表明LMCTS可能通過(guò)調(diào)節(jié)促炎性因子的釋放以及拮抗氧應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用,其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］GAO HC，ZHU K，GAO HM，er al.Role of tissue transglutaminase in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy and the intervention effect of rutin ［J］ Exp Ther Med，2015，9（4）：1103-1108

［2］任彥鋒，張帆，王莉，等，球囊損傷腹主動(dòng)脈大鼠血漿NO水平的變化及WSC對(duì)其影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷2013，08：1369-1371.

Q93

A

1674-2060（2016）03-0007-02

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：QN2014303）。