邵珍美

（山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院，山東煙臺264670）

免疫親和柱-高效液相法測定牛奶中嘔吐毒素

邵珍美

（山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院，山東煙臺264670）

建立一種快速、高效測定牛奶中的嘔吐毒素的免疫親和柱-高效液相方法。樣品前處理采用乙腈溶劑沉淀蛋白，用PBS緩沖液淋洗，乙腈洗脫后，洗脫液在40℃下氮吹干后，流動相復(fù)溶后檢測。采用Waters RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈-水（90∶10）作為流動相，用二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，嘔吐毒素在0.2 μg/mL～2.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 8，檢出限為0.12 mg/kg，定量限為0.40 mg/kg，加標(biāo)回收率達(dá)到82.2%～98.5%。

免疫親和柱；高效液相；牛奶；嘔吐毒素

嘔吐毒素（vomitoxin）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），屬于單端孢霉烯族B類，主要是由鐮孢屬中的禾谷鐮孢（玉米赤霉）和黃色鐮孢產(chǎn)生［1］（見圖1）。嘔吐毒素廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米、燕麥、大米、裸麥、高粱等谷類作物［2］，人和動物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。奶牛在食用了污染的谷物飼料后，在乳汁中也可檢測到相應(yīng)的霉菌毒素［3-6］，霉菌毒素種類與污染水平主要由谷物飼料被霉菌毒素污染的程度決定。近年來調(diào)查結(jié)果顯示［7-8］，我國部分飼料和原料污染霉菌毒素超標(biāo)的比例高達(dá)60%～70%，而嘔吐毒素的超標(biāo)比例接近70%。然而文獻(xiàn)中檢測牛奶中的嘔吐毒素的研究比較少，而且標(biāo)準(zhǔn)中沒有牛奶這一類物質(zhì)的前處理方法［9-10］，所以本文對這一類物質(zhì)進(jìn)行研究，以便對標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補充和輔助參考。

圖1　嘔吐毒素結(jié)構(gòu)圖Fig.1Structure of vomitoxin

目前嘔吐毒素的分析測定一般采用薄層色譜法（TLC）［11］、酶聯(lián)吸附免疫法（ELISA）［12］和高效液相色譜法（HPLC）［13-14］。TLC法繁瑣費時，且靈敏度、特異性較差，提取過程中所需有機(jī)溶劑品種多且量大，易污染環(huán)境，對人體有較大危害。而ELISA法測定結(jié)果受試劑盒差異、實驗溫度、儀器靈敏度等條件影響較大，重復(fù)性差，假陽性率高，難以達(dá)到相關(guān)技術(shù)要求。常規(guī)的HPLC法雖然比TLC靈敏度高，但由于樣品前處理手續(xù)繁瑣，操作復(fù)雜，也難以推廣。本文經(jīng)試驗摸索研究，建立了免疫親和凈化-反相高效液相-二極管陣列檢測器的方法，該方法回收率高、重復(fù)性好、操作簡便、快速靈敏，可作為牛奶中嘔吐毒素的測定方法參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

2695高效液相色譜系統(tǒng)（配2998二極管陣列檢測器）：Waters；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA。

嘔吐毒素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（200 μg/mL）：購于中國計量科學(xué)研究院；甲醇、乙腈為色譜純。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱：華安麥科。

1.2樣品制備

樣品均為市場上隨機(jī)購買牛奶。

1.3色譜條件

色譜柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

柱溫：30℃；檢測波長：218 nm。

1.4方法

1.4.1不同流動相體系對DON色譜行為的影響

參考相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)，固定流動相洗脫速度1.0 mL/min，選擇不同的流動相體系（體積比），流動相組成Ⅰ：甲醇-水（90∶10）；流動相組成Ⅱ：甲醇-水（80∶20）；流動相組成Ⅲ：乙腈-水（90∶10）；流動相組成Ⅳ：乙腈-水（80∶20）；考察對嘔吐毒素分析效果和出峰時間的影響，確定最佳流動相體系。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取適量的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0 μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3樣品前處理條件的優(yōu)化

在相關(guān)嘔吐毒素的檢測方法［9-10］中，未提及牛奶相關(guān)的前處理方法，若按酒類或者醬及醬制品處理后［10］，通過免疫親和柱時容易堵塞小柱，造成試驗結(jié)果不準(zhǔn)確，所以本試驗要設(shè)計初步提取牛奶中的嘔吐毒素的前處理方案，再進(jìn)行下步的免疫親和柱的富集和凈化。

在富集和凈化步驟選用的是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱，它基于抗原、抗體反應(yīng)的基礎(chǔ)上，抗體連接在柱體內(nèi)，樣品經(jīng)過提取、過濾后，緩慢的通過柱體，在免疫親和柱內(nèi)毒素與抗體結(jié)合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結(jié)合的其他無關(guān)物質(zhì)。用有機(jī)溶劑洗脫嘔吐毒素，經(jīng)氮吹干復(fù)溶后注入到儀器中檢測。但是在實際試驗中效果并不理想，雜質(zhì)干擾峰較多，加標(biāo)回收率不高，所以本試驗也要優(yōu)化相關(guān)的富集和凈化過程的條件，結(jié)果都以樣品加標(biāo)平均回收率為比較依據(jù)，來制定較優(yōu)的前處理條件。

1.4.4加標(biāo)回收試驗

以未檢出嘔吐毒素的牛奶為空白基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.5 mg/kg～2.0 mg/kg之間，選擇優(yōu)化后的前處理條件操作，氮吹近干后再用流動相定容至2.0mL，過0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測，計算回收率。

2結(jié)果與分析

2.1流動相體系對嘔吐毒素色譜行為的影響

為了了解流動相體系對嘔吐毒素色譜行為的影響，本研究固定流動相洗脫速度，改變流動相體系的組成和比例，流動相組成Ⅰ：甲醇-水（90∶10）；流動相組成Ⅱ：甲醇-水（80∶20）；流動相組成Ⅲ：乙腈-水（90∶10）；流動相組成Ⅳ：乙腈-水（80∶20），考察對嘔吐毒素色譜行為的影響。結(jié)果表明：流動相組成Ⅰ～Ⅳ都能有效的分離出目標(biāo)峰，且峰型良好；但出峰時間有所差別，流動相組成Ⅰ出峰時間為22.3 min；流動相組成Ⅱ出峰時間為16.8 min；流動相組成Ⅲ出峰時間為12.0 min；流動相組成Ⅳ出峰時間為7.6 min?？紤]到時間因素的影響，時間太長會浪費流動相，時間太短的目標(biāo)峰雜質(zhì)峰會分不開，所以綜合考慮選擇流動相組成Ⅲ作為本試驗的流動相體系，色譜圖如圖2所示。

圖2　嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.2Chromatogram of vomitoxin standard substance

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

為了驗證嘔吐毒素在乙腈-水（90∶10）溶液流動相體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個濃度重復(fù)測定3次，試驗結(jié)果表明，嘔吐毒素在0.2 μg/mL～2.0 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到目標(biāo)組分的LOD和LOQ分別為0.12 mg/kg和0.40 mg/kg，結(jié)果見表1。

表1　嘔吐毒素的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of vomitoxin

2.3提取溶液的選擇

考慮到嘔吐毒素易溶于極性的溶劑如水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，以及牛奶主要含蛋白質(zhì)的特性，提取溶液分別選擇甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯以及乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀體系進(jìn)行比較，主要目的就是沉淀牛奶中的蛋白質(zhì)將樣品中嘔吐毒素提取到溶劑中來。在有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯沉淀牛奶中的蛋白質(zhì)后，上清液若直接過免疫親和柱會破壞柱子中的抗體活性，所以先將沉淀后的上清液旋蒸干后，用水復(fù)溶后過柱；而乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀后上清液需要調(diào)節(jié)pH值至中性后上柱。試驗結(jié)果以嘔吐毒素的回收率為比較依據(jù)。

結(jié)果顯示：在牛奶樣品中加入提取溶劑后，樣品中的蛋白質(zhì)都會得到沉淀，但是沉淀的效果不同，導(dǎo)致過濾后樣液澄清度不一樣，沉淀效果從差到好依次是：乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈，乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀體系與乙腈沉淀效果差不多；所以我們選擇乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀體系與乙腈沉淀后的上清液進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙腈作為提取溶液樣液上機(jī)后的色譜圖中雜質(zhì)干擾峰減少，樣品的加標(biāo)回收率高于乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀體系作為提取溶液的結(jié)果，所以以下實驗都選擇乙腈作為嘔吐毒素的提取溶液，加入樣品沉淀蛋白質(zhì)后，上清液旋蒸干后，用水復(fù)溶后過柱。

2.4免疫親和柱淋洗液、洗脫液以及加標(biāo)方式的選擇

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品資料，在樣液上柱后，對牛奶樣品的淋洗液分別選擇水和PBS緩沖液進(jìn)行比較；洗脫液選擇甲醇、乙腈兩種溶劑進(jìn)行比較。

對于加標(biāo)回收試驗，由于標(biāo)準(zhǔn)品是溶于甲醇-乙酸乙酯混合溶液里的，考慮到乙酸乙酯溶劑峰干擾的問題，比較兩種加標(biāo)方式Ⅰ：將標(biāo)準(zhǔn)品直接加入到樣品里，Ⅱ：將標(biāo)準(zhǔn)品加入容器氮吹干后，用甲醇溶解后加入。

結(jié)果顯示：在免疫親和柱淋洗步驟，水的淋洗速度比PBS緩沖液快，但是對于有顏色的調(diào)制牛奶樣品來說，PBS緩沖液能淋洗的更干凈，綜合考慮還是PBS緩沖液作為淋洗液；在免疫親和柱洗脫步驟，甲醇和乙腈的洗脫效果差不多，但是考慮到流動相的組成中含有乙腈，所以選擇乙腈作為洗脫液；對于加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)方式Ⅰ的色譜圖明顯有一個很大的溶劑峰，而加標(biāo)方式Ⅱ則沒有溶劑峰的干擾，所以加標(biāo)方式Ⅱ明顯優(yōu)于加標(biāo)方式Ⅰ，譜圖結(jié)果如圖3所示。

圖3　加標(biāo)方式對嘔吐毒素色譜圖的影響Fig.3The effect of adding standard method on the vomitoxin chromatogram

2.5樣品的測定及加標(biāo)回收

在我們隨機(jī)購買的40個批次的牛奶樣品中，根據(jù)上述試驗結(jié)果選用乙腈提取，PBS緩沖液淋洗，乙腈洗脫后，洗脫液在40℃下氮吹干后，2 mL流動相復(fù)溶后，上機(jī)檢測。結(jié)果表明：優(yōu)化后的試驗條件，前處理簡單、凈化效果好、靈敏度高和檢測速度快，樣品上機(jī)后的色譜圖中雜質(zhì)峰對目標(biāo)峰的干擾少。在所檢測的牛奶制品中，嘔吐毒素結(jié)果均未檢出，加標(biāo)回收率82.2%～98.5%，符合檢測要求。

3結(jié)論

本文建立了一種免疫親和柱-高效液相法檢測牛奶制品中嘔吐毒素的分析方法。結(jié)果表明，在乙腈-水（90∶10）體系中，乙腈比例對于溶質(zhì)的色譜保留行為具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力，嘔吐毒素得到了良好的基線分離。牛奶樣品用乙腈溶劑提取后，上清液氮吹干后，用水復(fù)溶后上免疫親和柱，用PBS緩沖液淋洗，乙腈洗脫后，洗脫液在40℃下氮吹干后，2 mL流動相復(fù)溶后，上機(jī)檢測后色譜譜圖中可有效去除牛奶制品中的復(fù)雜基質(zhì)對目標(biāo)峰的影響，實現(xiàn)對嘔吐毒素的凈化與富集。

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Determination of Vomitoxin in Milk by Highperformance Liquid Chromatography with Immunoaffinity Column

SHAO Zhen-mei
（Shandong Business Institute，Yantai 264670，Shandong，China）

A rapid and effective method was established for the determination of vomitoxin in milk．The samples were precipitated protein with acetonitrile，washing in PBS buffer and acetonitrile as eluent.The elution liquid was dried at 40℃under nitrogen，and detected after redissolved with mobile phase.The separation of target compound was performed on a Waters RP C18chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile-water（90∶10）as mobile phase，with diode array detector and external standard method peak area quantification.The linear range of vomitoxin was in the range of 0.2 μg/mL-2.0 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999 8.The detection limit was 0.12 mg/kg and the quantitative limit was 0.40 mg/kg.The recovery rate was 82.2%-98.5%.

immunoaffinitycolumn；highperformanceliquidchromatography；milk；vomitoxin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.040

2016-05-24

邵珍美（1980—），女（漢），講師，碩士，主要從事糧油食品研究工作。