張　莉　張　凡

(河北省宣化縣人民醫(yī)院，河北　張家口　075000)

?

子宮頸癌不同放療方式的療效及耐受機(jī)制

張莉張凡1

(河北省宣化縣人民醫(yī)院，河北張家口075000)

目的探討調(diào)強(qiáng)及盆野放療對(duì)晚期子宮頸癌的治療效果及耐受機(jī)制。方法選取2006年1月至2012年1月在河北省宣化縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院子宮頸鱗狀細(xì)胞癌晚期患者75例，婦科門診活檢病理確診，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組37例(調(diào)強(qiáng)放療)和對(duì)照組38例(盆野照射放療)，療程結(jié)束后觀察盆腔CT、彩色B型超聲等相關(guān)指標(biāo)在不同時(shí)間的變化，同時(shí)利用免疫組化對(duì)病理活檢標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)CD133、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物-1(Gli1)的表達(dá)情況。結(jié)果①放療3個(gè)月實(shí)驗(yàn)組完全緩解率(CR)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。6個(gè)月、12個(gè)月后實(shí)驗(yàn)組CR+部分緩解率(PR)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；早期并發(fā)癥兩組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；晚期并發(fā)癥實(shí)驗(yàn)組明顯少于對(duì)照組。②CD133陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%(50/75)，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的外層5～6層細(xì)胞(即腫瘤浸潤(rùn)前沿)，而中央?yún)^(qū)陽(yáng)性細(xì)胞較少且分散；Gli1陽(yáng)性表達(dá)率為70.7%(53/75)，陽(yáng)性細(xì)胞圍繞新生血管周圍較為明顯，浸潤(rùn)前沿分布較為分散且呈弱表達(dá)。CD133陽(yáng)性表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的組織分化程度、宮旁浸潤(rùn)、放療耐受相關(guān)，在中低分化、宮旁浸潤(rùn)組以及放療耐受組存在高表達(dá)，與相應(yīng)組別間存在明顯差異(P<0.05)；Gli1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑、盆腔腫大淋巴結(jié)、放療耐受相關(guān)，在直徑>4 cm、存在盆腔腫大淋巴結(jié)組以及放療耐受組存在高表達(dá)，與相應(yīng)組別間存在明顯差異(P<0.05)。③CD133、Gli1陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)分析顯示兩者存在直線正相關(guān)(r=0.563 1，P<0.05)。結(jié)論①調(diào)強(qiáng)適形放療技術(shù)應(yīng)用于晚期子宮頸癌患者近期療效明顯好于常規(guī)盆腔放療，遠(yuǎn)期并發(fā)癥較少。②子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中存在干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、Gli1的表達(dá)，與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的宮旁浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等危險(xiǎn)因素相關(guān)，且可能是其放療耐受的主要因素。

宮頸鱗狀細(xì)胞癌；放射治療；調(diào)強(qiáng)放療；耐受

晚期子宮頸鱗狀細(xì)胞癌主要的治療手段是放療，盆腔放療是傳統(tǒng)治療手段，調(diào)強(qiáng)放射治療提高了腫瘤區(qū)劑量，降低了正常組織的受照劑量，降低了患者不良反應(yīng)，放療耐受的影響因素較多，研究顯示腫瘤干細(xì)胞是放化療耐受的根源，其自我更新、分化、耐藥等特性導(dǎo)致腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。CD133是多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物(Gli)1是Hedgehog信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，對(duì)維持組織干細(xì)胞核膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和自我更新所必需。在子宮頸癌中有無(wú)表達(dá)以及與放療耐受關(guān)系未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)兩種因子的表達(dá)，探討腫瘤干細(xì)胞在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的分布規(guī)律以及在放療耐受中的作用機(jī)制。

1　資料與方法

1.1臨床資料本組75例子宮頸癌病例均放療前經(jīng)病理活檢診斷明確，均為鱗狀細(xì)胞癌，無(wú)肺臟、肝臟、腦等遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。隨機(jī)分成兩組，觀察組(調(diào)強(qiáng)放射治療組)37例，對(duì)照組38例(盆野放療組)，年齡39～62〔平均(51±8.4)〕歲。高分化26例，中分化32例，低分化17例。通過(guò)CT加強(qiáng)掃描及磁共振(MRI)獲得子宮頸癌實(shí)體瘤臨床病理資料，其中浸潤(rùn)子宮頸內(nèi)肌層(低于1/2肌層)45例，外肌層(大于1/2肌層)30例，宮旁浸潤(rùn)陽(yáng)性35例，無(wú)宮旁浸潤(rùn)40例，存在盆腔腫大淋巴結(jié)32例，無(wú)淋巴結(jié)腫大43例，腫瘤最大直徑≤4 cm共42例，>4 cm共33例。Ⅱ期30例，Ⅲ期24例，Ⅳ期21例。

1.2臨床治療及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

1.2.1子宮頸活檢確診及免疫組化檢測(cè)CD133、Gli1鼠抗人單克隆抗體均購(gòu)于福建邁新生物技術(shù)有限公司，DAKO公司生產(chǎn)，進(jìn)口分裝型，工作濃度1∶50～1∶200。 采用常規(guī)S-P法，各步驟間嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度，每次染色均設(shè)置陽(yáng)性及陰性對(duì)照。主要步驟：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%過(guò)氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)振洗，微波爐進(jìn)行抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過(guò)夜，二抗 、三抗各1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色10～15 min，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷：著色細(xì)胞<10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性。CD133陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞膜、Gli1陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)。

1.2.2調(diào)強(qiáng)放療方法將76%的泛影葡胺20 ml稀釋于800 ml純凈水中，于CT掃描前1 h囑患者口服，并囑患者憋尿保證膀胱充盈，腸管顯影，并給予陰道填浸潤(rùn)76%泛影葡胺薄紗條。掃描前制作腹腔的體位固定膜，掃描時(shí)靜脈注射碘海醇100 ml，進(jìn)行影像對(duì)比增強(qiáng)。掃描范圍自第3腰椎上緣至坐骨結(jié)節(jié)下5 cm，掃描層厚間隔均為5 μm。掃描圖像經(jīng)局域網(wǎng)傳輸至放療計(jì)劃設(shè)計(jì)系統(tǒng)Varian工作站。

靶體積及危及器官：逐層在CT層面勾畫大體腫瘤體積(GTV)包括子宮、子宮頸、陰道等原發(fā)腫瘤區(qū)域及腫大淋巴結(jié)；臨床靶體積(CTV)包括盆腔淋巴引流區(qū)域(包括髂總、髂外、髂內(nèi)、閉孔、陰道上1/2及陰道旁軟組織)。CTV的上界在腹主動(dòng)脈分叉處，下界在閉孔下緣或?qū)嶓w腫瘤下緣下3 cm；在CTV基礎(chǔ)上外放0.5～1.0 cm形成計(jì)劃靶區(qū)(PTV)；同時(shí)勾畫危及器官(OARS)：小腸、直腸、膀胱、股骨頭。

治療計(jì)劃設(shè)計(jì)：采用Varian加速器6 MV X線，所有計(jì)劃均在Varian工作站完成，采用7個(gè)野照射，角度分別為0°、50°、100°、150°、210°、260°、310°。要求95%等劑量曲線包繞PTV，99%等劑量曲線包繞GTV，CTV酌情給予46～50 Gy，GTV酌情給予52～58 Gy，并同時(shí)配合腔內(nèi)治療。

1.2.3盆腔野放療方法經(jīng)模擬機(jī)定位，上界：L5上緣水平；下界：閉孔下緣(陰道受侵下界為腫瘤下緣3 cm)；外界：髂最寬處外1.5～2.0 cm。給予全盆野DT 30 Gy后，四野照射DT20 Gy，并配合腔內(nèi)治療35～509 Gy。

1.3觀察指標(biāo)放療前后查血常規(guī)、肝腎功能、腫瘤標(biāo)志物、心電圖、胸部X線片，盆腔CT或彩色B型超聲，放療后3、6、12個(gè)月復(fù)查盆腔CT、彩色B型超聲比較腫瘤大小變化。

1.4療效及不良反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)束后根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行放療療效分析：完全緩解(CR，所見腫瘤完全消失并至少維持4 w以上)；部分緩解(PR，腫瘤病灶的最大直徑及最大垂直徑乘積減少50.0%以上，維持4 w以上)；無(wú)變化(NC，腫瘤病灶的兩徑乘積減少小于50.0%或增大25.0%以下，無(wú)新灶出現(xiàn))；進(jìn)展加重(PD，腫瘤病灶的兩徑乘積增大25%以上或出現(xiàn)新病灶)。不良反應(yīng)按WHO腫瘤治療毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0軟件行χ2及t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1放療療效放療3個(gè)月觀察組CR 35例，PR 1例，對(duì)照組CR 32例，PR 3例，兩組CR率(97.2% vs 92.1%)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.479 1,P>0.05)。6個(gè)月后復(fù)查觀察組CR 32例、PR 1例、PD 1例，對(duì)照組CR 24例、PR 2例、PD 5例、死亡1例，兩組緩解率CR+PR(89.1% vs 68.4%)，兩組比較差異(χ2=12.489 4,P<0.05)；12個(gè)月后復(fù)查觀察組CR 21例、PR 10例、PD 1例，對(duì)照組CR 13例、PR 10例、PD 6例、死亡1例，緩解率(83.8% vs 60.5%)，兩組緩解率比較差異顯著(χ2=14.670 2,P<0.05)。

2.2放射治療并發(fā)癥放射治療并發(fā)癥分為早期并發(fā)癥及晚期并發(fā)癥。早期并發(fā)癥多表現(xiàn)為外陰炎、胃腸道反應(yīng)、直腸反應(yīng)，觀察組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，晚期并發(fā)癥分為皮膚及皮下組織的改變、放射性腸炎及放射性膀胱炎的發(fā)生，觀察組均未出現(xiàn)，而對(duì)照組放療半年后皮膚變硬，色素沉著發(fā)生率為31.6%(12/38)，放射性腸炎發(fā)生率為26.3%(10/38)。

2.3CD133、Gli1表達(dá)以及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系CD133陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%(50/75)，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的外層5～6層細(xì)胞(即腫瘤浸潤(rùn)前沿)，而中央?yún)^(qū)陽(yáng)性細(xì)胞較少且分散；Gli1陽(yáng)性表達(dá)率為70.7%(53/75)，陽(yáng)性細(xì)胞圍繞新生血管周圍較為明顯，浸潤(rùn)前沿分布較為分散且呈弱表達(dá)。CD133陽(yáng)性表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的組織分化程度、宮旁浸潤(rùn)、放療耐受相關(guān)，在中低分化、宮旁浸潤(rùn)組以及放療耐受組存在高表達(dá)，與相應(yīng)組別間存在明顯差異(P<0.05)；Gli1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑、盆腔腫大淋巴結(jié)、放療耐受相關(guān)，在直徑>4 cm、存在盆腔腫大淋巴結(jié)組以及放療耐受組存在高表達(dá)，與相應(yīng)組別間存在明顯差異(P<0.05)。見表1。

表1　CD133、Gli1陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

與其他亞組比較：1)P<0.05

2.4CD133、Gli1陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)分析CD133、Gli1在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)間存在直線正相關(guān)(r=0.563 1，P<0.05)。

3　討　論

晚期子宮頸癌由于侵犯的范圍很難手術(shù)徹底切除病變組織，放療成為晚期子宮頸癌的有效治療手段之一。常規(guī)盆腔放射治療區(qū)域常包含小腸、直腸、膀胱，為了防止這些臟器的放射劑量超標(biāo)，治療技師対放射范圍和承受最大劑量進(jìn)行限制，這樣腫瘤區(qū)放射劑量的也相應(yīng)受到限制。調(diào)強(qiáng)適形放療采用逆行計(jì)劃系統(tǒng)，通過(guò)調(diào)整多個(gè)照射野內(nèi)的強(qiáng)度分布，得到高度適形的靶區(qū)三維劑量分布，從而可在不增加甚至減少周圍正常組織受照劑量前提下，達(dá)到增加靶區(qū)劑量，提高治療增益比的目的〔1～3〕。調(diào)強(qiáng)適形放療可以有效地把腫瘤靶區(qū)與鄰近敏感器官分隔開照射不同的劑量強(qiáng)度，從而高效地提高腫瘤控制率而最大限度減少敏感器官的照射劑量，同時(shí)，由于調(diào)強(qiáng)放療的劑量分布特點(diǎn)是處方劑量區(qū)緊貼靶區(qū)表面，高劑最區(qū)下降迅速，因此，小腸、膀胱、直腸接收到高劑量照射的體積顯著下降，從而有效地降低了放療并發(fā)癥的發(fā)生，較常規(guī)放療減輕了患者放療并發(fā)癥的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，明顯提高了生存質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明調(diào)強(qiáng)放療在達(dá)到較好治療效果的同時(shí)，通過(guò)變換照射野角度，降低鄰近臟器的放療劑量達(dá)到避免遠(yuǎn)期并發(fā)癥的作用。調(diào)強(qiáng)放療是替代常規(guī)放療治療晚期子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的新的有效手段。

盡管如此仍有部分患者出現(xiàn)放療耐受，目前有關(guān)放療耐受的機(jī)制主要是腫瘤局部微環(huán)境的乏氧狀態(tài)持續(xù)存在，而具有自我更新、多項(xiàng)分化潛能的腫瘤干細(xì)胞的存在對(duì)放化療的耐受成為研究的熱點(diǎn)。CD133是較為廣泛表達(dá)的干細(xì)胞標(biāo)記物，具有獨(dú)特的5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)大的N-糖基化細(xì)胞外環(huán)的跨膜糖蛋白，被認(rèn)為人類造血干細(xì)胞的特異性表面抗原。最近的研究顯示，直腸癌術(shù)前放化療增加直腸癌細(xì)胞CD133的表達(dá)〔4〕。研究證實(shí)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的干細(xì)胞來(lái)自CK7陽(yáng)性表達(dá)的子宮頸上皮儲(chǔ)備細(xì)胞，感染人乳頭狀瘤病毒(HPV)后這些細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞，主要分布在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)前沿〔5，6〕。本文推測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞自我更新特性促使其逃避放射線的攻擊，同時(shí)促血管新生進(jìn)一步加劇腫瘤不同區(qū)域的缺氧狀態(tài)，可能直接導(dǎo)致放療耐受。

Hedgehog-Pat/SMO-Gli信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條十分保守的信號(hào)通路，該通路在動(dòng)物的胚胎發(fā)育、組織分化等生命過(guò)程中調(diào)控著細(xì)胞分化與增殖，新近研究顯示該通路在腫瘤的發(fā)生中同樣發(fā)揮著重要的作用，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切〔7，8〕。Gli蛋白分子在腫瘤研究中受到廣泛的關(guān)注。脊椎動(dòng)物中存在3種Gli核轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3，均可直接與靶基因啟動(dòng)子的特定序列(5′-TGGGTGGTC-3′)結(jié)合，Gli1僅具有轉(zhuǎn)錄激活功能，而Gli2、Gli3具有激活與抑制的雙重活性。Gli調(diào)控的靶基因包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的CyclinD1、CyclinD2、血管生成相關(guān)基因VEGF，表皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)基因CXCR4、Snail1、Sip1、Elk1和Msx2及細(xì)胞侵襲相關(guān)基因Osteopontin等。Gli1的表達(dá)水平可以直接反映Hedgehog信號(hào)(HH)通路的活性狀態(tài)。本文發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Gli1蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Rodova等〔9〕報(bào)道前列腺癌的Gli1增加異位表達(dá)可以使其轉(zhuǎn)移活性由低向高轉(zhuǎn)化，siRNA技術(shù)干擾Gli1蛋白表達(dá)可以控制前列腺癌細(xì)胞增殖，并促使其凋亡。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Gli1的表達(dá)與血管新生密切相關(guān)，微血管密度增加導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，體積增大伴隨臨床分期增加，同時(shí)新生血管的結(jié)構(gòu)不成熟導(dǎo)致腫瘤局部乏氧，促進(jìn)腫瘤放療耐受；微血管密度增加的同時(shí)也增加了宮旁浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，因此陽(yáng)性表達(dá)組盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于陰性組。

干細(xì)胞生存所需的微環(huán)境稱niche，其中Hedgehog信號(hào)途徑對(duì)干細(xì)胞的增殖生存是必需的，研究顯示Hedgehog信號(hào)調(diào)節(jié)膠質(zhì)Hedgehog母細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤，慢性粒細(xì)胞白血病中腫瘤干細(xì)胞的生存，且Hedgehog-Gli信號(hào)是維持成熟神經(jīng)干細(xì)胞和CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖和自我更新所必需的〔10，11〕。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD133、Gli1的陽(yáng)性表達(dá)間存在正相關(guān)，說(shuō)明Gli1通過(guò)維持子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中干細(xì)胞的生存導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展和放療耐受。

1Chéreau E，F(xiàn)eron JG，Ballester M，etal.Contribution of pelvic and para-aortic lymphadenectomy with sentinel node biopsy in patients with ⅠB2-ⅡB cervical cancer〔J〕.Br J Cancer,2012；106(1)：39-44.

2Sanuki N，Urabe S，Matsumoto H，etal.Evaluation of microscopic tumor extension in early-stage cervical cancer：quantifying subclinical uncertainties by pathological and magnetic resonance imaging findings〔J〕.J Radiat Res,2013；54(4)：719-26.

3Patil VM，Patel FD，Chakraborty S，etal.Can point doses predict volumetric dose to rectum and bladder：a CT-based planning study in high dose rate intracavitary brachytherapy of cervical carcinoma〔J〕.Br J Radiol,2011；84(1001)：441-8.

4Johannes Fredebohm，Michael Boettcher，Christian Eisen，etal.Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival〔J〕.Cancer Res,2011；71(11)：3991-4001.

5Ebben JD，Treisman DM，Zorniak M，etal.The cancer stem cell paradigm：a new understanding of tumor development and treatment〔J〕.Exp Opin Ther Targets,2010；14(6)：621-32.

6Lin SP，Lee YT，Wang JY，etal.Survival of cancer stem cells under hypoxia and serum depletion via decrease in PP2A activity and activation of p38-MAPKAPK2-Hsp27〔J〕.PLoS One,2012；7(11)：e49605.

7Heddleston JM，Hitomi M，Venere M，etal.Glioma stem cell maintenance：the role of the Microenvironment〔J〕.Curr Pharm Des,2011；17(23)：2386-401.

8Singh A，Park H，Kangsamaksin T，etal.Keratinocyte stem cells and the targets for non-melanoma skin cancer〔J〕.Photochem Photobiol,2012；88(5)：1099-110.

9Rodova M，F(xiàn)u J，Watkins DN，etal.Sonic hedgehog signaling inhibition provides opportunities for targeted therapy by sulforaphane in regulating pancreatic cancer stem cell self-renewal〔J〕.PLoS One,2012；7(9)：e46083.

10Varnat F，Duquet A，Malerba M，etal.Human colon cancer epithelial cells harbour active HEDGEHOG-GLI signalling that is essential for tumour growth，recurrence，metastasis and stem cell survival and expansion〔J〕.EMBO Mol Med,2009；1(6-7)：338-51.

11Tang SN，F(xiàn)u JS，Nall D，etal.Inhibition of sonic hedgehog pathway and pluripotency maintaining factors regulate human pancreatic cancer stem cell characteristics〔J〕.Int J Cancer,2012；131(1)：30-40.

〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

張凡(1968-)，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理研究。

張莉(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

R711.74

A

1005-9202(2016)15-3742-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.061

1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院