胡　霞　陳方方　孔陳蘇

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆　烏魯木齊　830011)

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脂聯(lián)素對(duì)帕金森病模型大鼠免疫炎癥及氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

胡霞陳方方孔陳蘇1

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆烏魯木齊830011)

目的探討脂聯(lián)素(APN)對(duì)帕金森病(PD)模型大鼠免疫炎癥及自由基損傷的保護(hù)作用。 方法采用6-羥多巴胺單側(cè)損毀左側(cè)紋狀體建立PD大鼠模型，選取40只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和APN組各20只，APN組分別于第1、8、15天經(jīng)鞘內(nèi)注射人工合成的APN 60 μg/kg，模型組僅接受鞘內(nèi)注射人工腦脊液。另取20只正常大鼠(僅行紋狀體定位而不注射6-羥多巴胺)作對(duì)照。分別于治療前及治療1、2、3 w后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為學(xué)及自主活性觀察，檢測(cè)各組治療3 w后損毀側(cè)紋狀體的炎性因子〔腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-6〕、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)〔丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和過(guò)氧化氫酶(CAT)〕及神經(jīng)遞質(zhì)〔多巴胺(DA)、二羥基苯乙酸 (DOPAC)和高香草酸 (HVA)〕水平，免疫組化法檢測(cè)損毀側(cè)紋狀體的酪氨酸羥化酶 (TH)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組治療前后的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均升高，自主活動(dòng)次數(shù)降低(P<0.05)；模型組和APN組治療前旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和自主活動(dòng)次數(shù)無(wú)顯著差異，但APN組治療后的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和自主活動(dòng)次數(shù)均優(yōu)于模型組(P<0.05)，且APN組各時(shí)間點(diǎn)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和自主活動(dòng)次數(shù)均有顯著差異(P<0.05)。與對(duì)照組相比，模型組的炎性因子及MDA含量升高，SOD、GSH-Px和CAT活性、神經(jīng)遞質(zhì)水平及TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.05)；APN處理后可改善PD大鼠的以上異常指標(biāo)(P<0.05)，與對(duì)照組的仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論APN對(duì)PD大鼠紋狀體免疫炎癥及自由基損傷具有保護(hù)作用，可能與改善損毀側(cè)紋狀體的神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。

脂聯(lián)素；帕金森??；免疫炎癥；自由基損傷；神經(jīng)遞質(zhì)

新近研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在帕金森病(PD)疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用〔1〕。此外，PD黑質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)內(nèi)源性氧自由基堆積，不僅加重了腦組織損傷，同時(shí)在一定程度上加速了黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)受損，繼而導(dǎo)致進(jìn)行性退變〔2〕。脂聯(lián)素(APN)是一種由脂肪組織分泌的活性物質(zhì)，除調(diào)節(jié)糖脂代謝外還具有多種生物活性〔3～5〕。此外，李芹等〔6〕發(fā)現(xiàn)APN具有神經(jīng)保護(hù)作用，可改善大鼠腦缺氧灌注損傷。APN能否改善PD大鼠的癥狀、免疫炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究擬探討APN處理對(duì)PD大鼠損毀側(cè)紋狀體免疫炎癥及氧化應(yīng)激的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器重組球形APN購(gòu)自瑞士Enzo Life Sciences公司，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程公司，過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技公司，酪氨酸羥化酶(TH)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；儀器：小動(dòng)物腦立體定位儀及套管針(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)和5430R型冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.2動(dòng)物與分組選取體重為200～220 g的成年雄性SD大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，采用6-羥多巴胺單側(cè)損毀左側(cè)紋狀體建立PD大鼠模型，選取40只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和APN組各20只，APN組分別于第1、8、15天鞘內(nèi)注射人工合成的APN 60 μg/kg，模型組僅接受鞘內(nèi)注射人工腦脊液。另取20只正常大鼠(僅行紋狀體定位而不注射6-羥多巴胺單)作對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)中所用大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境下，可自由攝食、飲水，溫度控制(22±1)℃，相對(duì)濕度為50%～10%，明暗交替 12 h/12 h。

1.3PD模型大鼠的建立采用戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠頭部固定在立體定位以上，正中切口切開(kāi)顱頂皮膚，暴露前囟后，以前囟為準(zhǔn)，參照Paxinos和Watson鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行紋狀體立體，具體坐標(biāo)：前囟前1.0 mm，正中線左側(cè)3.0 mm，硬膜下4.0/5.0 mm。兩點(diǎn)分別注射2.5 μl和3 μl的6-羥多巴胺(3.6 mg/ml)，每次注射后留針5 min，緩慢將微量注射器拔出。造模后21 d腹腔注射5 ml/kg阿樸嗎啡以誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，以30 min內(nèi)轉(zhuǎn)速>210 r為造模成功。

1.4旋轉(zhuǎn)行為學(xué)觀察每組各選取8只大鼠，分別于治療前及治療1、2、3 w后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為學(xué)觀察，采用腹腔注射阿樸嗎啡以誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，每次觀察時(shí)間為30 min，連續(xù)觀察2～3次，最終結(jié)果取30 min內(nèi)轉(zhuǎn)圈數(shù)的均值。

1.5自主活動(dòng)觀察每組各選取8只大鼠，分別于治療前及治療1、2、3 w后將其放入自主活動(dòng)箱內(nèi)，采用自動(dòng)記錄儀記錄大鼠的自主活動(dòng)次數(shù)，最終結(jié)果表示為10 min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)。

1.6紋狀體的炎性因子及活性物質(zhì)檢測(cè)每組取8只大鼠，于治療3 w后采用頸椎脫臼法處死，將損毀側(cè)紋狀體取出，經(jīng)液氮處理后充分研磨，高速離心后采用BCA法檢測(cè)上清液蛋白水平，采用相關(guān)試劑盒檢測(cè)損毀側(cè)紋狀體的TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平及SOD、GSH-Px和CAT活性。最終結(jié)果表示為每mg單位蛋白對(duì)應(yīng)的各指標(biāo)水平。

1.7神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)將1.6制備的損毀側(cè)紋狀體勻漿液，經(jīng)超聲破碎后離心，采用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，取50 μl待測(cè)，采用1200型高效液相色譜儀檢測(cè)多巴胺(DA)、二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)水平。

1.8免疫組化于末次行為學(xué)觀察結(jié)束后，每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死后取腦組織，經(jīng)修剪后，低溫下冰凍切片機(jī)行冠狀切片，片厚10 μm，隔5張取1只，依次經(jīng)抗原修復(fù)、封閉、加TH一抗、二抗、辣根酶標(biāo)記、顯色、復(fù)染、脫水及二甲苯透明后，在高倍顯微鏡下觀察TH的陽(yáng)性表達(dá)情況，計(jì)算每個(gè)組織的TH陽(yáng)性表達(dá)率，操作步驟完全遵循免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)、單因素分析。

2　結(jié)　果

2.1APN對(duì)PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的影響與對(duì)照組(設(shè)為0)相比，模型組治療前后的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均升高(P<0.05)；模型組和APN組治療前旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，APN組治療后均少于模型組(P<0.05)，且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠治療前后的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2APN對(duì)PD大鼠自主活動(dòng)的影響與對(duì)照組相比，模型組治療前后的自主活動(dòng)次數(shù)均降低(P<0.05)，主要表現(xiàn)活動(dòng)明顯減少、肢體震顫、反應(yīng)震顫、偏斜、弓背、后肢騷擾、躁動(dòng)及激惹等異常行為；模型組和APN組治療前自主活動(dòng)次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，APN組治療后均多于模型組(P<0.05)，且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠治療前后的自主活動(dòng)次數(shù)比較,次/10 min,n=8)

2.3APN對(duì)PD大鼠損毀側(cè)紋狀體炎性因子含量的影響與對(duì)照組相比，模型組損毀側(cè)紋狀體的TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高(P<0.05)；APN組含量低于模型組，但高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4APN對(duì)PD大鼠損毀側(cè)紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響與對(duì)照組相比，模型組損毀側(cè)紋狀體的DA、DOPAC和HVA水平均降低(P<0.05)；APN組均高于模型組，且對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3　各組大鼠損毀側(cè)紋狀體的炎性因子含量比較

表4　各組大鼠的損毀側(cè)紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)水平比較

2.5APN對(duì)PD大鼠損毀側(cè)紋狀體氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響與對(duì)照組相比，模型組損毀側(cè)紋狀體的MDA水平升高，但SOD、GSH-Px和CAT活性均降低(P<0.05)；APN組MDA水平低于模型組，SOD、GSH-Px和CAT活性均高于模型組(P<0.05)，且與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5　各組大鼠的損毀側(cè)紋狀體的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較±s,n=8)

2.6APN對(duì)PD大鼠損毀側(cè)紋狀體TH表達(dá)的影響對(duì)照組、模型組和APN組的損毀側(cè)紋狀體TH陽(yáng)性表達(dá)率依次為(56.21±12.78)%、(16.74±3.29)%和(38.44±6.11)%，三組差異顯著(P<0.05)。

3　討　論

PD是一種常見(jiàn)的老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、僵直及姿勢(shì)障礙等，DA的主要病因?yàn)橹心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失和紋狀體的DA濃度降低，故多巴替代療法是PD的首選方法，但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，藥效減弱直至完全失效〔1〕，故除補(bǔ)充多巴類制劑外，還應(yīng)聯(lián)合其他有效的手段，以緩解PD進(jìn)展。目前研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)均參與了PD的發(fā)病過(guò)程。多項(xiàng)研究表明緩解炎癥反應(yīng)及改善氧化應(yīng)激均可有效緩解PD癥狀并延緩進(jìn)展〔7～9〕，而APN有確切的抗感染、抗氧化作用。本研究采用經(jīng)典的紋狀體注射6-羥多巴胺的方法制備PD模型〔10,11〕，結(jié)果顯示APN可改善PD大鼠的癥狀，且APN對(duì)PD進(jìn)展有較好的延緩效果。

PD發(fā)生發(fā)展中的氧化應(yīng)激主要與氧自由基清除系統(tǒng)缺陷有關(guān)，造成紋狀體中大量的氧自由基堆積，不僅會(huì)通過(guò)氧化生物膜上的不飽和脂肪酸造成重要細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能損傷，而且會(huì)生成大量的過(guò)氧化物來(lái)?yè)p傷腦組織〔10〕。氧化應(yīng)激主要表現(xiàn)為氧化物增多及氧化物酶活性降低。本研究表明PD大鼠出現(xiàn)了內(nèi)源性的氧自由基堆積，與相關(guān)研究的結(jié)果一致〔2,7〕。另外APN治療可能需要更大的劑量或聯(lián)合其他手段才能發(fā)揮更好的效果。Fang等〔11〕發(fā)現(xiàn)APN可通過(guò)AMPK和cAMP來(lái)緩解血管緊張素誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞氧化應(yīng)激，本研究推測(cè)APN也可能通過(guò)AMPK和cAMP途徑來(lái)發(fā)揮對(duì)PD氧化應(yīng)激的改善作用。

炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)毒性是PD發(fā)病及進(jìn)展的重要因素，而炎癥因子可通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡，故緩解炎癥反應(yīng)對(duì)于PD的治療有重要意義〔12〕。前炎癥細(xì)胞因子在維持神經(jīng)系統(tǒng)上發(fā)揮重要作用，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷性刺激或小膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí)，會(huì)釋放大量的前炎癥細(xì)胞因子，來(lái)?yè)p害黑質(zhì)DA神經(jīng)元功能，最終參與了PD的病變過(guò)程〔13〕。本研究表明APN可降低PD大鼠的炎癥反應(yīng)，繼而起到對(duì)黑質(zhì)紋狀體DA神經(jīng)元的保護(hù)作用。

神經(jīng)遞質(zhì)在維持神經(jīng)元功能上發(fā)揮了重要作用〔14〕。本研究提示APN對(duì)PD大鼠紋狀體免疫炎癥及自由基損傷具有保護(hù)作用，可能與改善損毀側(cè)紋狀體的神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)，在PD防治中有較好的價(jià)值。

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〔2015-12-11修回〕

(編輯滕欣航)

孔陳蘇(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事運(yùn)動(dòng)障礙性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)變性病研究。

胡霞(1974-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事運(yùn)動(dòng)障礙性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)變性病研究。

R749

A

1005-9202(2016)15-3662-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.023

1新疆鄯善縣人民醫(yī)院