符少萍　王吉文　黃子通　陳煥清

(中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院預(yù)防保健科，廣東　廣州　510120)

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腦缺血/再灌注致心肌損傷大鼠心肌內(nèi)皮素和降鈣素基因相關(guān)肽的變化

符少萍王吉文1黃子通1陳煥清

(中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院預(yù)防保健科，廣東廣州510120)

目的探討內(nèi)皮素(ET)-1和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在大鼠腦缺血/再灌注期間心肌中的變化以及在繼發(fā)心肌損傷中的作用。方法將大鼠隨機分成假手術(shù)組(n=48)、腦缺血組(n=80)、再灌注組(n=80)，通過栓塞右側(cè)大腦中動脈(MCAO)法制備腦缺血/再灌注模型，測定腦缺血及再灌注0、6、12、24、48、72 h的腦缺血區(qū)域面積、血清肌酸激酶-同工酶(CK-MB)濃度、心肌中ET-1、CGRP含量變化，比較各指標在同一時點及不同時點間的變化以及分析CK-MB、ET-1、CGRP之間關(guān)系。結(jié)果腦缺血組血CK-MB、心肌ET-1均逐漸升高，12 h達峰值，其后逐漸下降；心肌CGRP于6 h開始下降，12 h達最低值，其后逐回升。 再灌注組CK-MB、ET-1 均于12 h達到峰值，其后下降，CGRP于12 h達最低值，其后回升。缺血組、再灌注組ET-1/CGRP均在6 h開始升高，12 h達峰值，其后逐漸下降，在72 h仍明顯高于0 h(P<0.05)。與腦缺血組比較，再灌注組腦缺血面積在 24、48、72 h 明顯減少(P<0.05)，CK-MB、ET-1 在 6、12 h明顯升高(P<0.05)，CGRP在 6、12 h 明顯降低(P<0.05)。血CK-MB與心肌ET-1/CGRP相關(guān)(r=0.547 7，P<0.05)。心肌病理表現(xiàn)為炎性細胞浸潤、心內(nèi)膜炎、肌纖維變性、灶性壞死等。結(jié)論心肌ET-1、CGRP參與腦缺血/再灌注后的繼發(fā)心肌損傷過程，心肌損傷程度與心肌ET-1升高程度、CGRP降低程度有關(guān)。

腦缺血/再灌注；內(nèi)皮素-1；降鈣素基因相關(guān)肽；心肌損傷；肌酸激酶-同工酶(CK-MB)

早期溶栓再灌注是臨床上治療缺血性腦卒中常用的方法，內(nèi)皮素(ET)是強有力的內(nèi)源性血管收縮肽，降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是內(nèi)源性保護心肌的神經(jīng)多肽，急性腦缺血再灌注后血中ET-1分泌增加、CGRP分泌減少〔1〕，但有關(guān)心肌中ET-1和CGRP的變化以及它們在繼發(fā)心肌損傷中的作用報道甚少。為了解急性腦缺血后心肌中ET-1 和CGRP的變化及再灌注對其的影響，探討二者在腦缺血/再灌注術(shù)后心肌損傷中的作用，本研究采用大鼠腦缺血/再灌注模型對心肌中的ET-1和CGRP含量變化及其與血中CK-MB的關(guān)系進行研究。

1　資料與方法

1.1動物將健康月齡6～8個月、體質(zhì)量220～250 g的208只雄性SD大鼠(中山大學(xué)動物實驗室提供)隨機分成3組：假手術(shù)組(對照組，n=48)；腦缺血組(n=80)；再灌注組(n=80)。再根據(jù)腦缺血時間將腦缺血組、再灌注組則隨機分成 6、12、24、48、72 h 共5小組(n=16)，將假手術(shù)組隨機分成 0、6、12、24、48、72 h共6小組(n=8)，其中假手術(shù)組的0 h作為3組的共同0時點。

1.2方法

1.2.1模型制定以頂端燙制成光滑球狀(直徑0.25～0.30 mm)的尼龍線作為栓子，參照張忱等〔2〕報道的方法通過大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞(MCAO)法制備腦缺血/再灌注模型。再灌注組則在腦缺血后1 h，拔出栓線實現(xiàn)再灌注。

1.2.2模型成功標準參考Kuluz等〔3〕神經(jīng)缺陷三級評分標準，腦缺血組于腦缺血后1 h評分達2級以上視為腦缺血模型成功；再灌注組于腦缺血后1 h符合以上標準，且拔栓線后動物成活2 h以上，顱底無出血，Willis環(huán)內(nèi)無血栓形成，視為再灌注成功標準〔4〕。

1.2.3標本采集及處理各組動物于各時點予麻醉后處死，迅速剖腹于下腔靜脈取血，剖胸取心臟組織和開顱取腦組織。

1.2.3.1取血測CK-MB濃度取血2 ml，在3 000 r/min離心10 min，取血清標本50 μl稀釋5倍后用自動生化儀采用酶聯(lián)速率法測定血清肌酸激酶-同工酶(CK-MB)濃度。

1.2.3.2取心臟行病理檢查剖胸取出心臟后迅速用冰鹽水沖洗，取左心室沿冠狀面中點分成兩部分，取前部分用10%甲醛溶液浸泡，石蠟包埋固定，切片常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌病理變化。

1.2.3.3取心肌測ET-1、CGRP含量取上述后部分心肌吸去血跡稱質(zhì)量，盡快放入生理鹽水1 ml中研磨勻漿，4℃3 000 r/min離心15 min，取上清液以5倍磷酸緩沖液(PBS)稀釋。用放射免疫分析法檢測ET-1、CGRP含量。

1.2.3.4取腦TTC染色和測量開顱取腦后，冠狀位視交叉處起切下一厚約2 mm的腦片，置于10%TTC溶液中避光、37℃恒溫30 min后，肉眼觀察并數(shù)碼標化攝像。經(jīng)Photoshop軟件處理后用Scion Image圖像軟件測量腦缺血面積與同側(cè)腦面積的比率。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗、方差分析、相關(guān)分析(α=0.05)。

2　結(jié)　果

2.1各組血清CK-MB濃度變化腦缺血組血清CK-MB濃度在6 h開始升高，12 h達高峰，而后逐漸下降，再灌注組CK-MB變化規(guī)律與腦缺血組類同。再灌注組CK-MB在6 h、12 h均較腦缺血組的明顯升高(P<0.05)。假手術(shù)組CK-MB在各時點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組心肌 ET-1 、CGRP含量的變化腦缺血組、再灌注組心肌ET-1含量均在6 h開始升高，12 h達峰值，而后逐漸下降。腦缺血組、再灌注組心肌CGRP含量均在6 h開始降低，12 h達最低值，而后逐漸回升。腦缺血組、再灌注組ET-1/CGRP均在6 h開始升高，12 h達峰值，之后逐漸下降，在72 h仍明顯高于0 h(P<0.05)。假手術(shù)組心肌ET-1、CGRP含量、ET-1/CGRP在各時點比較均無差異性(P>0.05)。見表2。

表1　各組大鼠血CK-MB 濃度的變化

與腦缺血組同時點比較：1)P<0.05，表3同

表2　各組大鼠心肌 ET-1 、CGRP含量的變化

與腦缺血組同時點比較：1)P<0.05；與假手術(shù)組同時點比較：2)P<0.05

2.3各組腦壞死組織與同側(cè)冠狀面積之比的變化腦缺血組腦壞死面積與同側(cè)冠狀面積之比隨時間延長逐增大，至12 h達高峰，之后有逐漸下降；再灌注組腦壞死面積比在12 h達峰值，隨后逐漸下降，且在24、48、72 h較腦缺血組腦壞死面積明顯減少(P<0.05)。 假手術(shù)組未見腦壞死組織，見表3。

2.4腦缺血組與再灌注組的心肌病理改變光鏡下心肌細胞：腦缺血后6 h開始出現(xiàn)纖維排列不規(guī)則，參差不齊，有顯著的嗜伊紅帶，而后大部分心肌可見炎性細胞浸潤、心內(nèi)膜炎，部分可見肌纖維變性、灶性壞死等病理改變，偶見大面積心肌壞死。再灌注組在6 h、12 h各病理表現(xiàn)均有較腦缺血組發(fā)生率增高的趨勢，但均無明顯差異性。腦缺血組繼發(fā)心肌損傷的總發(fā)生率為77.5%，再灌注組的為80%，兩組間總的心肌病理異常發(fā)生率無明顯差異性(P>0.05)。

表3　各組大鼠腦壞死面積占同側(cè)冠狀面積的比率

2.5心肌中CK-MB與ET-1/CGRP的相關(guān)性對所有樣本心肌中CK-MB與ET-1/CGRP進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者在α=0.05水平相關(guān)(r=0.547 7，P<0.05)。

3　討　論

本研究結(jié)果說明腦缺血再灌注可減少腦缺血壞死的面積，對缺血的腦組織有保護作用，早期再灌注治療缺血性腦卒中有積極意義。

本研究中，腦缺血后血CK-MB濃度逐漸升高，于12 h達峰值，其后逐漸下降，同時心肌病理顯示心肌有炎性細胞浸潤、心內(nèi)膜炎、肌纖維變性、灶性壞死等心肌損傷的病理改變。根據(jù)血CK-MB升高及心肌陽性病理改變說明大鼠腦缺血后繼發(fā)有心肌損傷。本實驗中腦缺血繼發(fā)心肌損傷的發(fā)生率為77.5%，可見MCAO易繼發(fā)心肌損傷，其發(fā)生率較高。本研究提示，腦缺血再灌注后使繼發(fā)的心肌損傷較單純腦缺血所繼發(fā)者加劇，這是臨床上腦缺血再灌注治療中不可忽視的問題。

ET和CGRP是一對血管舒縮功能調(diào)控作用完全相反的神經(jīng)多肽，二者的動態(tài)平衡對維持心血管系統(tǒng)的正常生理功能具有極重要作用。ET中以ET-1作用最強，ET-1是強有力的內(nèi)源性血管收縮肽，對動脈有強烈的收縮作用，且以冠脈最為敏感〔5〕，故ET-1對心臟氧供以負性作用為主。CGRP是一種由降鈣素基因表達的含37個氨基酸殘基的生物活性多肽，是迄今發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強的舒血管神經(jīng)肽，廣泛分布于神經(jīng)和心血管系統(tǒng)，對全身血管有不同程度的擴張作用，尤對腦、心血管的作用更為顯著，并有拮抗ET的作用〔6〕。

本研究提示腦缺血后心肌ET-1產(chǎn)生增多，心肌CGRP產(chǎn)生減少，ET-1、CGRP參與腦缺血后繼發(fā)心肌損傷的過程。急性腦缺血可作為一種應(yīng)急原而引起機體產(chǎn)生全身性應(yīng)激反應(yīng)，心血管系統(tǒng)是應(yīng)激反應(yīng)的主要效應(yīng)器官，其應(yīng)激反應(yīng)主要由交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)。腦缺血后心肌ET-1升高機制可能與腦缺血后出現(xiàn)全身應(yīng)激反應(yīng)、心臟血管內(nèi)皮細胞受損、高濃度的茶堿對ET-1誘導(dǎo)作用等有關(guān)〔7〕。升高的心肌 ET-1與心肌細胞上的ETA 受體結(jié)合親和力強，使心肌細胞鈣超負荷，引起鈣介導(dǎo)的血管平滑肌和心肌收縮，抑制心肌能量代謝，促進血管活性物質(zhì)釋放等，從而導(dǎo)致心肌損傷，使血中CK-MB升高。腦缺血后CGRP也應(yīng)相應(yīng)增加以拮抗ET的作用，但由于CGRP降解速度快，加之ET過度增加從而導(dǎo)致CGRP降低。研究表明，用CGRP灌注離體大鼠缺血心臟可明顯減輕心肌細胞損傷；CGRP可拮抗內(nèi)皮素作用，抑制鈣內(nèi)流，減輕心肌損傷〔8〕。腦缺血后心肌ET-1含量增高，CGRP含量降低造成以ET-1占優(yōu)勢的ET-1與CGRP的平衡失調(diào)，CGRP對心肌組織保護作用減弱，ET-1對心肌負性作用增強，引起冠脈收縮和心肌低灌注狀態(tài)，從而引起心肌損傷。

本研究結(jié)果提示腦缺血再灌注后使繼發(fā)的心肌損傷較單純腦缺血所繼發(fā)者加劇，故考慮再灌后心肌損傷加重與心肌ET-1合成釋放明顯增多、CGRP明顯減少、ET-1/CGRP比例明顯失調(diào)有關(guān)。再灌后應(yīng)激反應(yīng)加劇、自由基增多、鈣超載、炎癥細胞激活、血管內(nèi)皮細胞損害加重等可引起心肌ET-1合成釋放明顯增多、CGRP明顯減少。心肌中高濃度的ET-1通過使冠脈強烈收縮、對心臟組織直接毒性作用等作用來加劇對心肌的損傷。心肌CGRP明顯減少，其對心肌組織的保護作用明顯減弱，因而心肌損傷愈發(fā)嚴重。

本研究顯示在大鼠腦缺血后，血清CK-MB的動態(tài)變化與心肌ET-1的變化相一致，心肌ET-1和心肌CGRP變化呈相反趨勢，心肌中CK-MB與ET-1/CGRP有顯著性相關(guān)。這結(jié)果進一步表明，腦缺血后繼發(fā)心肌損傷的嚴重程度與心肌ET-1升高程度、CGRP下降程度有關(guān)，腦缺血后心肌 ET-1 和 CGRP在心肌損傷中作用是相反的。

腦缺血后可繼發(fā)心肌損傷，腦缺血再灌注后使繼發(fā)的心肌損傷加劇，這是臨床上腦缺血治療中不可忽視的問題。本研究為腦缺血后再灌注繼發(fā)心肌缺血損傷機制提供了相關(guān)的理論依據(jù)，提示在腦缺血后及時調(diào)節(jié)體內(nèi)ET-1與CGRP水平，降低心肌ET-1含量，同時提高CGRP合成以調(diào)節(jié)兩者平衡，可降低腦缺血/再灌注后繼發(fā)心肌損傷，尚需臨床上進一步試驗證實。

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8萬小華，譚道全.缺氧時大鼠降鈣素基因相關(guān)肽含量變化與心肌損傷關(guān)系探討〔J〕.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003；43(2)：44.

〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

符少萍(1971-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事老年疾病防治研究。

R743

A

1005-9202(2016)15-3657-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.021

1中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院急診科