趙麗艷　李相軍　張秀云　苗春生　李　才　劉昕鳴

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林　長(zhǎng)春　130041)

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人參糖肽對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞損傷的改善作用

趙麗艷李相軍1張秀云1苗春生1李才1劉昕鳴

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林長(zhǎng)春130041)

目的探討人參糖肽對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)引起大鼠胰島β細(xì)胞損傷的改善和防護(hù)作用。方法腹腔注射STZ損傷雄性Wistar大鼠胰島為胰島損傷組；注射STZ前連續(xù)7 d腹腔注射人參糖肽保護(hù)胰島為人參糖肽組；以不經(jīng)任何處理的大鼠為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采用放射免疫分析法檢測(cè)大鼠血清胰島素和C肽含量，蘇木素-伊紅(HE)染色觀(guān)察胰島病理改變，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胰島素蛋白表達(dá)水平，電鏡觀(guān)察胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果與對(duì)照組相比，胰島損傷組大鼠血清胰島素和C肽含量顯著降低(P<0.01)，而人參糖肽組的血清胰島素和C肽含量較胰島損傷組明顯升高(P<0.01)。HE染色觀(guān)察顯示胰島損傷組胰島細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞排列不整，細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)破壞，人參糖肽組的胰島細(xì)胞損傷明顯改善。免疫組織化學(xué)研究顯示，胰島損傷組胰島素陽(yáng)性染色面積明顯縮小，而人參糖肽組的胰島素陽(yáng)性染色面積明顯擴(kuò)大(P<0.01)。胰島損傷組胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)為變性-壞死性改變且分泌顆粒極少，而人參糖肽組胰島β細(xì)胞變性-壞死性改變明顯改善，分泌顆粒顯著增多。結(jié)論人參糖肽能明顯改善STZ引起的大鼠胰島β細(xì)胞損傷。

人參糖肽；胰島β細(xì)胞；血清胰島素；超微結(jié)構(gòu)

人參糖肽是人參中的一種成分，其注射液是國(guó)家級(jí)治療糖尿病的中藥二類(lèi)新藥，以往的研究證明，人參糖肽能明顯降低實(shí)驗(yàn)性高血糖動(dòng)物的血糖水平〔1,2〕。在臨床上用人參糖肽治療2型糖尿(T2DM)患者后血糖水平明顯降低〔3〕，停藥4 w后血糖仍維持在較低水平〔4〕，但人參糖肽對(duì)血糖影響的機(jī)制尚不明確。胰島β細(xì)胞的重要功能是分泌胰島素，對(duì)機(jī)體糖代謝發(fā)揮重要影響，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。目前人參糖肽對(duì)胰島β細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)研究，本研究旨在探討人參糖肽對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)所致大鼠胰島β細(xì)胞損傷的改善效果。

1　材料與方法

1.1材料人參糖肽注射液由吉林省松原天實(shí)藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，使用時(shí)用生理鹽水配成所需濃度。STZ、胰島素抗體購(gòu)自Sigma公司。胰島素和C肽放射免疫分析試劑盒購(gòu)自中國(guó)原子能科學(xué)研究院同位素研究所；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。濃縮型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒及其他組化試劑購(gòu)自博士德公司。體重200～250 g雄性Wistar大鼠由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：吉科字950000010，醫(yī)動(dòng)字10-5110)。

1.2動(dòng)物分組和處理用生理鹽水將人參糖肽配成所需濃度，取8只大鼠按400 mg/kg體重腹腔注射人參糖肽，1次/d，連續(xù)7 d為人參糖肽組。取8只大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，末次注射后1 h，按60 mg/kg體重腹腔注射STZ胰島損傷組。注射STZ或生理鹽水后24 h腹主動(dòng)脈穿刺取空腹血液，分離血清，安樂(lè)死法處死大鼠取胰腺供形態(tài)學(xué)研究。取不經(jīng)任何處理的8只大鼠作為對(duì)照組。血清胰島素和C肽含量按放射免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色胰腺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，沿胰腺團(tuán)塊長(zhǎng)軸連續(xù)切片，以2 mm間隔制備4 μm切片6張，HE染色，顯微鏡下觀(guān)察胰島形態(tài)。胰島素免疫組化染色：石蠟切片脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，1%H2O2室溫孵育5 min，抗原修復(fù)液修復(fù)，山羊血清封閉后滴加胰島素一抗(1∶200)，4℃過(guò)夜，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。PBS漂洗，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS漂洗，加入SABC 37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡觀(guān)察反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色為陽(yáng)性反應(yīng)。利用Imagepro Plus 6.0分析軟件測(cè)定胰島素陽(yáng)性染色的面積和胰島面積，計(jì)算胰島素陽(yáng)性染色的面積占胰島面積的百分比，表示胰島素蛋白表達(dá)水平。

1.4胰島細(xì)胞電鏡觀(guān)察取小塊胰腺組織在含2.5%戊二醛固定液中細(xì)切成1 mm3小塊，用4%戊二醛前固定和1%鋨酸后固定，Epon 812包埋，制備半薄切片，顯微鏡下定位胰島后，用LKB-V型超薄切片機(jī)制備超薄切片，鈾和鉛雙重染色，JEM-1200EX透射電鏡觀(guān)察胰島超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS12.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1三組血清胰島素、C肽含量比較與對(duì)照組相比，胰島損傷組大鼠血清胰島素、C肽含量顯著降低(P<0.01)，而人參糖肽組較胰島損傷組均明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　血清胰島素和C肽含量

與對(duì)照組比較:1)P<0.01，與胰島損傷組比較:2)P<0.01

2.2HE染色觀(guān)察胰島病理變化對(duì)照組：胰腺組織中每個(gè)視野可見(jiàn)4～6個(gè)胰島，胰島呈橢圓形，胰島內(nèi)可見(jiàn)較多胰島細(xì)胞，細(xì)胞排列整齊，核呈圓形，染色質(zhì)均勻，無(wú)濃染細(xì)胞；胰島損傷組：胰島數(shù)量減少，分布稀疏，胰島細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞排列不整齊，大部分細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)著色淺，空泡增多，可見(jiàn)嗜伊紅細(xì)胞，核呈多邊形，染色質(zhì)分布不均勻；人參糖肽組：每個(gè)視野可見(jiàn)2～4個(gè)胰島，胰島細(xì)胞排列比較規(guī)整，核多為橢圓形，染色質(zhì)較豐富均勻，少數(shù)細(xì)胞質(zhì)呈嗜伊紅改變。見(jiàn)圖1。

2.3免疫組化染色觀(guān)察胰島素表達(dá)胰島β細(xì)胞胰島素陽(yáng)性表達(dá)于胞質(zhì)，呈棕黃色。對(duì)照組：胰島細(xì)胞分布規(guī)整，胰島內(nèi)可見(jiàn)大量染成濃重棕黃色的β細(xì)胞，胰島素陽(yáng)性染色面積百分比〔(89.9±24.2)%〕增大。胰島損傷組：胰島細(xì)胞腫脹，排列不規(guī)整，數(shù)量明顯減少，僅見(jiàn)少數(shù)染成淺淡黃色的β細(xì)胞，胰島素陽(yáng)性染色面積〔(38.8±8.2)%〕明顯縮小。人參糖肽組：與胰島損傷組相比，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞排列較規(guī)整，胰島素陽(yáng)性染色面積百分比〔(76.4±18.6)%〕明顯增大，著色增強(qiáng)。

圖1　各組大鼠胰島HE、免疫組化染色和β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.4胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變對(duì)照組：細(xì)胞核規(guī)則，核膜光滑，染色質(zhì)均勻分布，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量含有致密芯的分泌顆粒。胰島損傷組：呈變性、壞死性改變，胞核不規(guī)則，核膜皺褶、內(nèi)陷，染色質(zhì)濃集、邊聚，線(xiàn)粒體腫脹，嵴溶解，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多大小不一的空泡，分泌顆粒極少。人參糖肽組：胞核較規(guī)則，染色質(zhì)均勻分布，線(xiàn)粒體較多，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)一些空泡，分泌顆粒增多。見(jiàn)圖1。

3　討　論

人參糖肽為人參中天然降血糖成分，臨床應(yīng)用證明，人參糖肽具有降低糖尿病患者血糖的作用，但尚未闡明這種作用是否與保護(hù)胰島β細(xì)胞功能有關(guān)。胰島β細(xì)胞功能受損是決定血糖水平變化最為重要的因素，也是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的重要病理生理機(jī)制。評(píng)價(jià)β細(xì)胞功能對(duì)了解糖尿病的發(fā)生、發(fā)展甚至預(yù)測(cè)糖尿病的預(yù)后非常重要。胰島素由胰島β細(xì)胞分泌，是體內(nèi)唯一可降低血糖的激素，測(cè)定血胰島素含量可反映胰島β細(xì)胞的功能。以往研究表明，人參中抗糖尿病作用的有效成分主要有人參皂苷、人參多肽和人參多糖等〔5〕，但其降糖作用與胰島β細(xì)胞功能關(guān)系的研究很少。有研究證明，北美人參根的提取物能降低糖尿病小鼠血漿胰島素和C肽水平〔6〕。C肽是胰島β細(xì)胞的分泌產(chǎn)物，與胰島素等分子共同釋放，C肽穩(wěn)定好，不受外源性胰島素和血胰島素抗體的影響，已成為判斷胰島素分泌能力的一個(gè)良好指標(biāo)〔7〕。本研究結(jié)果表明，人參糖肽對(duì)胰島β細(xì)胞損傷具有較好的防護(hù)作用。

目前臨床上評(píng)估胰島β細(xì)胞功能的方法有10多種，但這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，尚不能精準(zhǔn)反映胰島β細(xì)胞功能質(zhì)和量的動(dòng)態(tài)變化均需進(jìn)一步完善〔8,9〕。形態(tài)學(xué)能更直觀(guān)顯示胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位改變，本研究表明人參糖肽處理可修復(fù)受損的β細(xì)胞，使胰島素蛋白表達(dá)水平增加。Lim等〔10〕研究顯示,口服高麗參提取物可降低環(huán)孢素引起的小鼠血糖水平，改善糖耐量，提高血清胰島素含量，增加胰島β細(xì)胞面積，證明高麗參對(duì)環(huán)孢素所致胰島β細(xì)胞損傷有防護(hù)作用。而且本研究結(jié)果為人參糖肽能明顯減輕胰島β細(xì)胞損傷提供了有力的形態(tài)學(xué)證據(jù)。

1Wang BX,Zhou QL,Yang M,etal.Hypoglycemic activity of ginseng glycopeptides〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2003;24(1):50-4.

2陳文學(xué),楊銘,于德偉,等.人參糖肽對(duì)糖尿病氣陰兩虛證大鼠降血糖作用及其機(jī)制研究〔J〕.中國(guó)藥學(xué)雜志,2014;49(21):1903-7.

3葛煥琦,蔡寒青,王濤,等.人參糖肽注射液治療2型糖尿病30例〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2003;29(2):206-7.

4張秋梅,張喆,于德民,等.人參糖肽治療2型糖尿病的臨床觀(guān)察〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2003;13(6):59-62.

5王麗杰,王春艷,張冬燕,等.人參治療糖尿病及作用機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2013;13(7):906-9.

6Sen S,Querques MA,Chakrabarti S.North American Ginseng(Panax quinquefolius)prevents hyperglycemia and associated pancreatic abnormalities in diabetes〔J〕.J Med Food,2013;16(7):587-92.

7Di Nardo F,Cogo CE,Faelli E,etal.C-Peptide-based assessment of insulin secretion in the Zucker fatty rat:a modelistic study〔J〕.PLoS One,2015;10(5):e0125252.

8Cersosimo E,Solis-Herrera C,Trautmann ME,etal.Assessment of pancreatic β-cell function:review of methods and clinical applications〔J〕.Curr Diabetes Rev,2014;10(1):2-42.

9陳晨,徐向進(jìn),陳頻.胰島β細(xì)胞功能評(píng)估〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2014;20(9):1561-4.

10Lim SW,Doh KC,Jin L,etal.Oral administration of ginseng ameliorates cyclosporine-induced pancreatic injury in an experimental mouse model〔J〕.PLoS One,2013;8(8):e72685.

〔2015-10-14修回〕

(編輯滕欣航)

吉林省科學(xué)技術(shù)廳資助項(xiàng)目(20010545)

劉昕鳴(1961-)，女，副教授，主要從事內(nèi)分泌代謝疾病臨床生化研究。

趙麗艷(1971-)，女，博士，副教授，主要從事代謝性疾病和抗病生物學(xué)研究。

R587.1;R965

A

1005-9202(2016)15-3638-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.012

1吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室