關(guān)　瑜　周翔宇　陳　垚

(吉林省食品藥品安全監(jiān)測中心，吉林　長春　130000)

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小分子抑制劑VLT對乳腺癌細(xì)胞生長的影響

關(guān)瑜周翔宇1陳垚

(吉林省食品藥品安全監(jiān)測中心，吉林長春130000)

目的研究小分子抑制劑VLT對乳腺癌細(xì)胞生長的影響。方法采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測乳腺癌細(xì)胞在不同時間段(12、48、72 h)的細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果小分子抑制劑VLT對乳腺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，并在48 h作用最為明顯；VLT 2 000 μg/ml組與正常對照組及VLT 1 000 μg/ml組比較顯著差異(P<0.05)；G0/G1期細(xì)胞顯著升高，S 期細(xì)胞數(shù)減少；細(xì)胞凋亡率明顯增加,VLT 2 000 μg/ml組分別與空白對照及VLT 1 000 μg/ml組比較均差異顯著(P<0.05)。結(jié)論小分子抑制劑VLT可能通過細(xì)胞周期的改變，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤生長作用。

小分子抑制劑VLT；乳腺癌

乳腺癌的發(fā)病原因包括遺傳性疾病、生活方式或飲食因素。其傳統(tǒng)的治療原則是術(shù)后先放療后化療或單獨(dú)放療/化療，但都難以提高其臨床療效〔1〕，目前國內(nèi)外已研究的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價格昂貴且不良反應(yīng)大。同時也存在耐藥性問題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制〔2～4〕，本實(shí)驗旨在研究小分子抑制劑VLT對乳腺癌細(xì)胞生長的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑及藥品 乳腺癌細(xì)胞株：購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。主要試劑：(1)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(產(chǎn)品編號：C1052)由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；(2)二甲基亞砜、四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)，美國Sigma 公司產(chǎn)品；(3)小分子抑制劑VLT由上海吉爾公司合成，純度為98%；(4)多西他賽由海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20093520。

1.2主要儀器(1)倒置顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三樣電機(jī)株式會社制造 產(chǎn)品型號：NCO-15AC)；(3)AN YANG 超凈臺 (中國蘇州安洋科技發(fā)展有限公司，型號：BSC-BOOⅡB2)；(4)流式細(xì)胞儀(美國becton-Dickson公司)；(5)酶標(biāo)儀(中國上海BIO-RAD公司，MODEL550型)

1.3方法(1)MTT法檢測細(xì)胞存活率:取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，計數(shù)，以每孔1×104/ml接種于96孔板中，100 μl/孔，終體積為200 μl，37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為空白對照組、多西他賽(100 μg/ml)組及不同濃度VLT(1 000、1 500、2 000 μg/ml)組，20 μl/孔，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液，每組分別設(shè)5個復(fù)孔。置入37℃、5%CO2培養(yǎng)，分別孵育24、48、72 h，每孔加入20 μl MTT孵育4 h，以二甲基亞砜(DMSO)每孔150 μl終止反應(yīng)。將96孔板移入平板振蕩器，水平振蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長測定吸光度(A)值，以空白對照孔A值凋零，記錄結(jié)果。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期:取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，計數(shù)，以每孔1×106/ml接種6孔板中，分組及給藥濃度方法同上，在培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，加入冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞輕輕吹打成單個細(xì)胞，離心，PBS洗2次，用500 μl PBS從懸細(xì)胞，每離心管中加入各100 μl〔1 mg/ml碘化吡啶(PI)、10 mg/ml RNaseA、0.01%Triton-X100〕，37℃避光染色30 min。采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期變化，結(jié)果以各個細(xì)胞周期所占的百分率表示。(3)Annexin V-FITC/PI 法分析細(xì)胞凋亡:取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，計數(shù)，以每孔5×105/ml接種6孔板中，分組及給藥濃度方法同上，在培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，并用冰冷的PBS洗滌，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，室溫(20℃～25℃)避光孵育10 min，加入10 μl PI染色液，輕輕混勻冰浴，避光放置，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1MTT法檢測細(xì)胞活性如表1所示，不同劑量小分子抑制劑-VLT作用于乳腺癌細(xì)胞在24 h時，各實(shí)驗組比較無顯著差異(P>0.05)。在48 h，VLT 2 000 μg/ml組與正常對照組及VLT 1 000 μg/ml組比較顯著差異(P<0.05)，VLT 2 000 μg/ml組與多西他賽組比較無顯著差異(P>0.05)；在72 h時,各實(shí)驗組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1　VLT對乳腺癌細(xì)胞增殖活性的影響值)

與VLT 2 000 μg/ml組比較：1)P<0.05；下表同

2.2小分子抑制劑-VLT對乳腺癌細(xì)胞周期和凋亡率檢測在48 h，VLT能夠引起乳腺癌細(xì)胞周期發(fā)生改變，VLT 2 000 μg/ml組G0/G1期比例明顯升高，S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞凋亡率明顯增加，分別與空白對照組及VLT 1 000 μl/ml組比較差異顯著(P<0.05)，VLT 2 000 μl/ml組與多西他賽組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　VLT對乳腺癌細(xì)胞周期及凋亡的影響

3　討　論

近年來，乳腺癌發(fā)病年齡有逐漸年輕化的趨勢〔5〕，由于發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，其治療一直沒有重大突破。目前主要通過手術(shù)治療，并聯(lián)合化療、放療減少腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，但其治愈率仍較低。

有研究報道，腫瘤的發(fā)生是多途徑、多步驟的，還與細(xì)胞凋亡有關(guān)，細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡已成為腫瘤治療的重要手段之一〔6～8〕。本實(shí)驗表明小分子抑制劑VLT 2 000 μg/ml組細(xì)胞生長具有明顯抑制作用。

研究表明，細(xì)胞癌變與細(xì)胞周期密切相關(guān)。多種抗腫瘤藥物對細(xì)胞周期有特異的阻滯作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞停滯在G2/M期而發(fā)揮治療作用〔9,10〕。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平具有直觀、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)〔11〕。本研究結(jié)果推測小分子抑制劑-VLT對乳腺癌細(xì)胞生長是通過阻滯G0/G1期細(xì)胞，使S期細(xì)胞減少，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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〔2016-03-22修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

陳垚(1964-),女，主任藥師，主要從事藥品安全性評價研究。

關(guān)瑜(1983-),女，主管藥師，主要從事藥品安全性評價研究。

R73

A

1005-9202(2016)15-3636-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.011

1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科