張新星　張　璐　顧　清　代小松　陳和平

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院　四川省人民醫(yī)院，四川　成都　610072)

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氧化苦參堿誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的機(jī)制

張新星張璐顧清代小松陳和平

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院，四川成都610072)

目的探討氧化苦參堿誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。方法以不同劑量的氧化苦參堿作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，Hoechst 33258 染色法觀測(cè)細(xì)胞凋亡。免疫印跡法測(cè)定B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá),熒光法測(cè)定半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的活性。結(jié)果氧化苦參堿可劑量依賴性地抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Western印跡方法顯示氧化苦參堿可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)激活凋亡效應(yīng)分子caspase-3。結(jié)論氧化苦參堿能夠抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖，通過提高Bax的表達(dá)、抑制Bcl-2的表達(dá)、激活caspase-3發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

氧化苦參堿；結(jié)腸癌；細(xì)胞凋亡

目前對(duì)于結(jié)直腸癌的治療手段主要是手術(shù)，術(shù)后聯(lián)合用氟尿嘧啶類藥物進(jìn)行化療。氧化苦參堿(Oxymatrine)是豆科屬植物苦參(SophoraflavescensAit)中分離出來的生物堿，具有很多生物活性，如抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、降壓、調(diào)節(jié)免疫等〔1〕。近年來的研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿具有顯著的抗腫瘤活性，不僅可以抑制乳腺癌、食管癌、骨肉瘤細(xì)胞的增殖，而且能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡〔2～4〕。然而針對(duì)氧化苦參堿治療結(jié)腸癌的研究較少。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480為研究對(duì)象,研究不同濃度氧化苦參堿對(duì)該細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞形態(tài)的影響。

1　材料與方法

1.1藥物及主要試劑氧化苦參堿、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、Hoechst 33258以及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3活性測(cè)定試劑盒購自Sigma；胎牛血清來自杭州四季青；RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶購自GIBCO。人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系,購自上海細(xì)胞所。α-Tubulin、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體購自Cell signaling technology。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)SW480細(xì)胞的培養(yǎng)基主要是1640，其中添加了10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml。37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶37℃消化2～4 min，隔天傳代換液，用于藥物實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞保持處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞增殖的檢測(cè)將SW480細(xì)胞制備成濃度為2×104/ml的細(xì)胞懸液,接種在96 孔板中。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同劑量的氧化苦參堿(終濃度0.5，1，2 mg/ml)和陽性藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu，終濃度10 μg/ml)，每組分別設(shè)置3個(gè)平行孔,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。藥物作用24 h后在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)后，加入10 μl MTT(終濃度5 g/L)檢測(cè)細(xì)胞活力。放入孵箱中反應(yīng)4 h后,每孔加入100 μl二甲基亞砜溶解結(jié)晶,利用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光吸收值(A)。

1.4Hoechst33258 染色細(xì)胞以1×104個(gè)/ml的濃度接種于無菌蓋玻片上,加入不同劑量藥物(終濃度0.5，1，2 mg/ml)處理24 h后,加入0.5 ml固定液(4%多聚甲醛)固定細(xì)胞30 min后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后加入Hoechst 33258(10 μg/ml)，蓋過蓋玻片為宜。避光放置在37℃恒溫箱中10 min，可在熒光顯微鏡下觀察。正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，而出現(xiàn)深染或破碎的藍(lán)色熒光則為凋亡的細(xì)胞。

1.5利用免疫印跡法(Western印跡)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞種植在6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，藥物處理24 h后，消化細(xì)胞，離心后加入細(xì)胞裂解液(加蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min，期間每隔5 min渦旋震蕩一次。離心取上清測(cè)蛋白含量，取20～50 μg蛋白加入等量上樣緩沖液，沸水中煮4 min使蛋白變性。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺(SDS/PAGE)凝膠電泳,之后利用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟丙烯(PVDF)膜。血清封閉后加入一抗(Bcl-2,Bax,α-Tubulin,1∶1 000)4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,再次洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑，曝光出現(xiàn)條帶后保存,利用IMAGE J軟件對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行灰度值掃描分析。

1.6利用熒光法測(cè)定caspase-3 的活性細(xì)胞種植在六孔板中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，藥物處理24 h后，消化細(xì)胞，離心后加入細(xì)胞裂解液。按試劑盒說明加入適當(dāng)裂解液，混勻后在冰上裂解30 min。裂解液在4℃下離心10 min (12 000 r/min),取上清液并測(cè)定蛋白含量。用細(xì)胞裂解液將樣本蛋白濃度調(diào)整到1～2 μg/μl。將50 μl反應(yīng)緩沖液加到96孔培養(yǎng)板上，之后加入熒光底物DEVD-AFC 5 μl，最后加入樣品50 μl,混勻后放入37℃恒溫箱中約1.5 h,取出后利用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm 處測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1形態(tài)學(xué)觀察氧化苦參堿對(duì)SW480細(xì)胞的作用加入不同劑量的氧化苦參堿作用24 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察到各加藥組細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組減少，細(xì)胞變圓并皺縮。見圖1。

2.2氧化苦參堿對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響0.5，1，2 mg/ml的藥物可顯著抑制細(xì)胞增殖〔增殖率分別為(87.7±3.5)%，(62.5±3.1)%，(46.5±4.2)%〕，且呈劑量依賴性關(guān)系，分別為正常對(duì)照組〔(100.0±2.1)%〕的87.7%，62.%和46.5%，陽性藥物5-Fu組〔(42.1±1.2)%〕為對(duì)照組的42.1%，均有顯著性差異(P<0.01)。

2.3氧化苦參堿誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的凋亡見圖2。加入氧化苦參堿的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，其細(xì)胞核的胞膜結(jié)構(gòu)完整，但胞核發(fā)生碎裂或者濃縮，表現(xiàn)為致密的熒光，各濃度的氧化苦參堿均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖1　氧化苦參堿對(duì)SW480細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

圖2　氧化苦參堿對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

2.4氧化苦參堿對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的影響藥物處理細(xì)胞24 h后,蛋白印跡條帶結(jié)果顯示氧化苦參堿能抑制Bcl-2表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)Bax表達(dá),且呈劑量依賴性(P<0.01)。見圖3，表1。

圖3　氧化苦參堿對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

指標(biāo)正常對(duì)照組氧化苦參堿0.5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/mlBcl-2100.0±4.168.9±5.51)43.5±2.11)39.5±5.21)Bax100.0±4.7119.8±6.51)184.0±5.11)221.0±9.21)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01

2.5氧化苦參堿對(duì)caspase-3活性的影響 藥物處理24 h后與正常對(duì)照組細(xì)胞〔(100.0±5.7)%〕相比，0.5、1、2 mg/ml的氧化苦參堿能增強(qiáng)caspase-3 的活性〔分別為(134.8±5.5)%、(199.1±8.2)%、(235.2±10.2)%〕，藥物劑量越大，caspase-3活性越高(P<0.01)。

3　討　論

有研究數(shù)據(jù)顯示：60%以上腫瘤患者為65歲以上老年人，老年人患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)是中青年的11 倍，且消化道腫瘤所占比例最大〔5〕。研究報(bào)道老年人在手術(shù)切除腫瘤后的術(shù)后并發(fā)癥和死亡率是其他年齡組的2～4倍，且此類手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡的增長(zhǎng)而增高〔6〕。在我國，同樣有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)老年患者因合并基礎(chǔ)疾病多，術(shù)后發(fā)生并發(fā)癥的比例可高達(dá)21.67%〔7〕。老年患者甚至因基礎(chǔ)狀況差無法承擔(dān)手術(shù)及放化療等治療方案，尋求一種相對(duì)有效及安全的治療方法可以改善老年結(jié)腸癌患者預(yù)后。

氧化苦參堿是從豆科槐屬植物苦參中提取的一類生物堿，目前在臨床上主要用于治療多種原因引起的急慢性肝損害。此外，一般應(yīng)用化療藥物會(huì)引起病人的白細(xì)胞減少，氧化苦參堿可用于治療這類反應(yīng)?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)其具有較好的抗腫瘤活性，文獻(xiàn)報(bào)道氧化苦參堿能夠誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7發(fā)生凋亡,抑制小鼠肉瘤細(xì)胞株S180和骨肉瘤細(xì)胞株OS732的增殖〔2～4〕。更值得關(guān)注的是氧化苦參堿能夠抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖的作用〔8〕,同時(shí)還有提高免疫活性輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)以及白細(xì)胞數(shù)量的作用，進(jìn)而提高整個(gè)機(jī)體的免疫能力。最近還有研究表明氧化苦參堿有鎮(zhèn)痛作用〔9〕。以上的這些作用使氧化苦參堿在抗腫瘤藥物研發(fā)中更具優(yōu)勢(shì)。臨床常用的康艾注射液已被證實(shí)可用于原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌等惡性腫瘤，且有較好的抑瘤作用,其主要的抑瘤成分即為氧化苦參堿〔10〕。本研究結(jié)果表明氧化苦參堿可劑量依賴性的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)。在細(xì)胞凋亡過程中許多蛋白起著關(guān)鍵的作用，如Bcl-2蛋白家族。Bcl-2蛋白家族可分為抗凋亡亞族和促凋亡亞族，Bcl-2與Bax是主要的抗凋亡和促凋亡蛋白之一。前期大量研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白的表

達(dá)增強(qiáng)后，引起B(yǎng)cl-2與Bax蛋白比值的增高，在這種情況下可以抑制細(xì)胞的凋亡；反之，如果Bax蛋白表達(dá)增多，Bcl-2與Bax蛋白比值會(huì)下降，在這種情況有可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔11〕。細(xì)胞凋亡的最后過程是通過caspase的激活而實(shí)現(xiàn)的，其級(jí)聯(lián)式激活并溶解蛋白質(zhì)〔12〕。caspase-3不僅是細(xì)胞凋亡的下游分子，也是效應(yīng)分子，caspase-3被激活后，細(xì)胞凋亡基本上是不可避免的〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氧化苦參堿可呈劑量依賴性抑制Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá),激活caspase-3，提示氧化苦參堿誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制可能與其抑制抗凋亡Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、提高凋亡下游關(guān)鍵蛋白酶caspase-3 活性有關(guān)。

1李正蓉.苦參素的藥理與臨床研究進(jìn)展〔J〕.華西藥學(xué)雜志,2003;18(6):435-7.

2周炳剛,孫靖中,范玉琢,等.氧化苦參堿誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 凋亡的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào),2002;18(6):689-91.

3張立明,鄭傳莉.氧化苦參堿誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2006;26(10):1218-9.

4靳毅,胡建莉,彭綱,等.氧化苦參堿誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株Eca109 凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009;29(11):891-4.

5王鶴,喬友林.老年惡性腫瘤流行病學(xué)、病因及預(yù)防〔J〕.中華老年多器官疾病雜志,2005;4(3):170-2.

6Seymour DG. Gastrointestinal surgery in old age: issues of equality and quality〔J〕.Gut,1997;41(4):427-9.

7張躍華.老年結(jié)腸癌451例治療體會(huì)〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2008;23(1):90.

8王兵,王國俊,蔡雄,等.氧化苦參堿抑制肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的研究〔J〕.腫瘤防治雜志,2003;10(7):707-9.

9姜靜,馮建偉,陳靖,等.氧化苦參堿的鎮(zhèn)痛作用〔J〕.中藥藥理與臨床,2012;28(6):50-2.

10黃素培,郜娜,喬海靈.康艾注射液對(duì)HO-8910腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2011;31(14):1187-90.

11Galluzzi L,López-Soto A,Kumar S,etal.Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis〔J〕.Immunity,2016;44(2):221-31.

12Savitskaya MA,Onishchenko GE.Mechanisms of apoptosis〔J〕.Biochemistry(Mosc),2015;80(11):1393-405.

13Fulda S.Targeting apoptosis for anticancer therapy〔J〕.Semin Cancer Biol,2015;31:84-8.

〔2015-11-17修回〕

(編輯袁左鳴)

The apoptosis of colon cancer SW480 cells induced by oxymatrine

ZHANG Xin-Xing,ZHANG Lu,GU Qing,et al.

Sichuan Academy of Sciences &Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072,Sichuan,China

ObjectiveTo explore the apoptosis induction effects of oxymatrine and its mechanism on the human colon cancer SW480 cell line.MethodsThe morphological changes of SW480 cells after treatment with different concentrations of oxymatrine were observed. The proliferative ability and the apoptosis of SW480 cells were separately detected by MTT method and Hoechst 33258 staining. The expressions of Bcl-2 and Bax were analyzed by Western blot and Caspase-3 activity was detected by biochemical fluorescent.ResultsThe proliferation of SW480 cells was remarkably inhibited by 0.5,1 and 2 mg/ml oxymatrine. Oxymatrine induced apoptosis of SW480 cells. Moreover,oxymatrine downregulated Bcl-2 expression and upregulated Bax expression. The activity of Caspase-3 was also activated by oxymatrine.ConclusionsOxymatrine is able to inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SW480 cells significantly. The mechanisms of oxymatrine on the apoptosis of SW480 cells might be realized by depressing Bcl-2 expression,enhancing Bax expression,and activating caspase-3 activity.

Oxymatrine;Colon cancer;Apoptosis

國家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB707900);四川省科技廳項(xiàng)目(2015SZ0039；2013JY0194)；成都市衛(wèi)生局項(xiàng)目(2013006)

張新星(1979-)，女，碩士，主要從事老年消化相關(guān)疾病的研究。

R73

A

1005-9202(2016)15-3618-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.004