蔣　麗　劉健華　黃鍵澎　謝長才　符文彬

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東　廣州　510120)

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電針對變應性接觸性皮炎小鼠模型的止癢效果及免疫調節(jié)機制

蔣麗劉健華黃鍵澎謝長才符文彬

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東廣州510120)

目的觀察電針從心脾論治對變應性接觸性皮炎模型小鼠瘙癢和皮炎的治療作用，并探討其對Th1 /Th2平衡的免疫調節(jié)作用機制。方法將30只雌性BALB /c小鼠分為空白組、ACD模型組和電針組，每組10只。除空白組外，其他組均以2，4-二硝基氯苯(DNCB)誘導建立變應性接觸性皮炎動物模型，共刺激10次。電針組在造模第8天同時給予電針治療?？瞻捉M和模型組不給予任何治療。觀察小鼠搔抓次數、腹部皮損變化，采用H&E染色檢測皮膚組織病理學變化，ELISA法檢測血清中白介素4(IL-4)、干擾素γ(IFN-γ)免疫學指標水平變化。結果與空白組比較，模型組小鼠搔抓次數顯著升高，腹部皮膚產生濕疹樣皮炎；血清IL-4、IFN-γ表達明顯下降。與模型組比較，電針組小鼠的搔抓次數明顯減少，腹部皮損炎癥和鏡下表皮增厚明顯減輕，血清中IFN-γ含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。結論電針從心脾論治能減輕ACD模型小鼠的皮膚瘙癢，改善皮膚炎癥癥狀；電針可能是通過促進IFN-γ分泌，從而調節(jié)Th1 /Th2 失衡，發(fā)揮對ACD小鼠模型的止癢作用。

電針;變應性接觸性皮炎模型;干擾素-γ;白介素-4

變應性接觸性皮炎(ACD)是接觸性變應原引起的一種變態(tài)反應,也是一種由多種炎癥細胞參與的慢性、復發(fā)性、瘙癢性皮膚疾病〔1,2〕。頑固強烈的瘙癢癥狀是ACD最重要的臨床癥狀，其引起的“瘙癢-搔抓”惡性循環(huán)，是導致ACD皮損產生并反復加重，嚴重影響ACD患者的身心健康和生活質量的主要原因之一〔3～6〕。針灸治療瘙癢性皮膚病在我國已有悠久歷史。臨床研究證實，電針治療ACD在控制炎癥，減輕瘙癢方面有效，尤其在止癢方面效果明顯〔7,8〕。但是，有關電針對ACD誘發(fā)的實驗性瘙癢療效及作用機制研究在國內鮮有報道。本研究觀察電針從心脾論治對小鼠瘙癢行為以及皮損狀況的影響，探討電針治療ACD的Th1/Th2平衡的免疫作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組方法6～8周齡的健康雌性SPF級BALB/c小鼠30只〔廣東省醫(yī)學實驗動物中心，合格證號SCXK(粵)2013-0002〕，體重20～25 g，實驗室溫度(24 ± 2)℃，相對濕度55%～65%，晝夜時間控制在各12 h，給予3 d適應性喂養(yǎng)。將30只雌性BALB/c小鼠隨機分為3組，即空白組、模型組和電針組，每組10只。除空白組外，其余2組均需造模。

1.2藥物與試劑2，4-二硝基氯苯(DNCB，Sigma 公司)，白介素(IL)-4、干擾素(IFN)-γ試劑盒(均購于MultiSciences公司)、P物質試劑盒(USCNK公司)。將DNCB 溶解于丙酮/橄欖油(1∶4)基質溶液中，分別配制成濃度1%和2%的DNCB致敏溶液。

1.3主要儀器低速離心機(中佳SC3614)、低溫冷凍離心機(黑馬Min1612R)、勻漿機(Bertin Precellys 24)，紫外線分光光度儀(Thermo Nanodrop 2000C)，酶標儀(thermo multiskanMK3)、顯微鏡(Leica DMI6000B)。華佗牌電子針治療儀(型號：SDZ-Ⅴ型，蘇州醫(yī)療用品廠出產)、一次性針灸針(0.22 mm×25 mm)，華佗牌28 號1寸毫針(蘇州醫(yī)療用品廠出產)。

1.4ACD模型的建立ACD小鼠模型的建立參考文獻〔9～11〕方法并略有改進：實驗前2日剃去小鼠腹部體毛，面積約2.5 cm×2.5 cm。實驗第1天用2% DNCB丙酮溶液100 μl涂于腹部剃毛處、四肢和耳部，實驗第2～4天不作處理，第5天改用1%DNCB 丙酮溶液100 μl涂搽小鼠的腹部剃毛處和耳部，以后每隔2 d刺激1次，造模期共29 d，共刺激10次。以造模結束時,小鼠腹部皮膚出現紅斑、水泡、滲出，部分可見糜爛、上覆黃色痂皮，耳部出現腫脹、滲出和結痂為造模成功?？瞻捉M小鼠腹部脫毛區(qū)及耳部僅涂搽丙酮/橄欖油基質溶液，涂搽時間及涂搽劑量與模型組一致。

1.5治療方法電針組在造模期第8天開始接受電針治療。每次電針干預于DNCB刺激前5 h進行。取穴內關、足三里穴，穴位定位根據《實驗針灸學》常用實驗動物針灸穴位定位方法，以動物比較學方法定位。用一次性針灸針沿皮斜刺入上述穴位皮下4 mm，針柄連接電針儀,選擇疏密波刺激,5～10次/s，頻率2/100 Hz,電流強度1～2 mA (先1 mA,然后逐漸加大到2 mA),以小鼠肢體肌肉輕微顫動為宜。每次治療30 min，隔天治療1次，共治療3 w?？瞻捉M和ACD模型組不給予任何治療。電針組末次治療后24 h內，3組小鼠均眼球取血，并切取腹部皮膚做病理切片。

1.6檢測指標

1.6.1小鼠搔抓次數記錄將各組小鼠單籠放置，采用視頻攝像機記錄并計數10 min內小鼠的搔抓次數，以后肢連續(xù)搔抓耳部及腹部視為一次搔抓活動，當后爪落地或被舔舐時代表本次搔抓結束。前肢的活動以及后爪對面、背部等處的搔抓則不作統(tǒng)計。分別于實驗開始前及實驗開始后每1周各觀察1次，共觀察5次。

1.6.2觀察皮損表現肉眼觀察各組小鼠皮損表現情況并拍照記錄。

1.6.3小鼠腹部皮損組織病理檢查于末次電針治療結束后24 h內取各組小鼠腹部皮損組織約1.5 cm×1.5 cm 大小，用10%甲醛浸泡24 h固定，脫水后做透明處理，浸蠟，石蠟包埋，切片，HE染色后在顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.6.4血清IL-4、IFN-γ水平檢測于末次電針后24 h內，各組小鼠麻醉后摘眼球取血，室溫放置2 h后1 000 r/min離心20～30 min。取血清于-80℃保存，血清各指標ELISA檢測均按照試劑盒說明書操作。用酶標儀測定OD450 nm值，根據標準曲線計算出相應的樣本濃度值，單位為pg/ml。

1.6.5體重于實驗開始前、實驗第8天及實驗結束時分別檢測3組小鼠的體重。

1.7統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，繼以LSD檢驗進行兩組間比較；不滿足正態(tài)分布和方差齊性時，采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。

2　結　果

2. 1不同組別小鼠搔抓次數評分3組小鼠搔抓次數組間有顯著性差異(F=101.898，P<0.01)；進一步兩兩比較顯示，實驗結束當日，模型組和電針組的搔抓次數均顯著升高，分別與空白組比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)；與模型組比較，電針組小鼠搔抓次數顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.354，P=0.004)(表1)。

2. 2不同組別小鼠體重評分各時點3組小鼠的體重均無統(tǒng)計學差異(F=2.117，P=0.143)(表1)。

表1　3組小鼠各觀察時點搔抓次數和體重的比較±s,n=10)

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2. 3各組小鼠腹部皮損表現見圖1?？瞻捉M小鼠腹部皮膚基本無變化，僅有輕微潮紅，未見明顯水腫、斑丘疹、滲出及結痂(圖1a)。模型組和電針組小鼠腹部皮膚均在致敏第4天開始出現水腫、表皮增厚等改變；隨著時間推移，癥狀逐漸加重，包括表皮脫落、滲出、皮疹、苔蘚樣變等表現；至實驗第29天時，腹部皮膚表現為紅斑、丘疹，糜爛面逐漸結痂，可見黃色厚薄不一的痂皮等濕疹樣皮炎的改變(圖1b)。電針組小鼠腹部皮損表現與模型組相似，但是于電針治療1 w后，小鼠腹部皮膚紅斑、皮疹、滲出、結痂等的皮炎癥狀較模型組均逐漸減輕，并且在實驗結束時可見毛發(fā)不同程度恢復生長(圖1c)。

2. 4小鼠腹部皮損組織病理改變情況見圖2。對照組小鼠腹部皮膚組織結構基本正常，未見明顯炎性細胞浸潤(圖2a)；ACD模型組小鼠腹部皮損的表皮細胞間水腫，角化過度伴角化不全，棘層增厚，血管擴張充血，真皮內可見慢性炎細胞浸潤(圖2b)；電針組小鼠腹部皮損組織棘層輕度增厚，細胞內水腫，血管輕度擴張，少量炎癥細胞浸潤(圖2c)。

圖1　各組小鼠實驗結束時腹部皮損表現

圖2　小鼠腹部皮損組織病理形態(tài)觀察(HE，×400)

2. 5血清IL-4 、IFN-γ水平比較見表2。IL-4 、IFN-γ水平分別進行3組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空白組相比，模型組小鼠血清IL-4含量顯著增高(P<0.01)；IFN-γ水平顯著降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比，電針組IFN-γ水平顯著升高(P<0.01)，但IL-4水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2　各組小鼠血清IL-4 、IFN-γ水平比較

3　討　論

ACD是一種瘙癢反復發(fā)作的皮膚慢性炎癥性疾病，劇烈瘙癢、濕疹樣皮損和皮膚干燥是其主要特點。由于搔抓而刺激炎癥因子和瘙癢介質大量釋放，并對神經纖維產生刺激，反過來又可誘發(fā)和加重瘙癢和皮損，形成“瘙癢-搔抓” 惡性循環(huán)，這是導致ACD皮損產生并反復加重、纏綿不愈呈慢性病程發(fā)展的主要原因，也是嚴重影響ACD患者身心健康和生活質量的重要原因〔3，4〕。因此對ACD治療的關鍵在于治癢。研究和探討ACD患者慢性瘙癢機制，以改善瘙癢癥狀，打破癢-搔抓惡性循環(huán)，對于ACD的治療具有重要意義。

運用針灸治療瘙癢性皮膚病在我國已具有悠久歷史。近年來，大量研究報道了電針止癢的療效，其中一項研究顯示電針能夠減輕健康受試者身上由皮內注射組胺引起的實驗性瘙癢和皮疹；動物實驗也顯示電針可以有效減輕尿毒癥性皮膚瘙癢〔12～15〕。針灸止癢的機制研究顯示〔16〕，針刺可降低慢性蕁麻疹患者血清組胺及總IgE水平，表明針刺能有效抑制活躍的變態(tài)反應。此外，針刺在一定程度上可以抑制嗜酸性粒細胞的聚集和活化，起到治療炎癥及抑制瘙癢的作用。有關針灸治療ACD的報道也日益增多,國內外幾項臨床研究顯示針灸治療ACD在減輕瘙癢、調節(jié)免疫功能，控制炎癥方面均具有較好的療效，其中止癢效果尤為顯著，相對當前的西藥治療更安全無毒副作用〔7，8,17～20〕。盡管針灸治療ACD的療效在臨床研究中已得到證實，但是它的作用機制仍然相對缺乏。

辨證取穴是針灸治病的首要環(huán)節(jié)，也是影響針灸療效的關鍵因素。ACD在中醫(yī)學中歸屬于四彎風、浸淫瘡等瘡、蘚類范疇。依據《素問·至真要大論》有云：“諸痛癢瘡，皆屬于心”，“諸濕腫滿,皆屬于脾”；《醫(yī)宗金鑒》云“凡諸瘡作癢，皆屬于火”，“浸淫瘡，……由心火脾濕受風而成”等醫(yī)籍記載，可將該病病位歸屬于心、脾，病機主要為心火脾虛，濕熱蘊結，其中該病兩個最主要癥狀“癢”責之于“心”，皮損、滲液責之于“脾”。中醫(yī)認為，心為主神之所，是情志活動的發(fā)源地，瘙癢、疼痛等感覺均由心之神明感知。脾虛心血不足，心神失養(yǎng)，則肌膚粗糙、瘙癢無度。脾虛濕邪內生，皮膚濕熱浸淫，則發(fā)為濕疹。因此，本病治心調脾，安神健脾尤為必要。有學者以心脾失調理論指導辨證論治，運用培土清心法治療變應性接觸性皮炎，可明顯緩解瘙癢癥狀，改善神經及免疫系統(tǒng)功能，而奏清心安神，健脾止癢之效〔21〕。本實驗中所選內關穴為手厥陰心包經的絡穴，溝通表里經，且心包代心受邪，又是八脈交會穴之一，通于陰維脈，有寧心安神，調和情志的作用。足三里則為調理脾胃之要穴，可調理脾胃，健運脾濕。兩穴共用起到清心安神、健脾除濕之功。

免疫調節(jié)是針灸的重要作用之一。許多學者認為,ACD是一種免疫失衡性疾病，其中以Th1/Th2類細胞及其分泌的細胞因子平衡失調在ACD的發(fā)生發(fā)展中起到尤為重要的作用〔22，23〕。輔助T細胞(Th)是免疫反應中的關鍵細胞，可分為Th1和Th2兩個亞群。IFN-γ是Th1細胞分泌的代表性因子，介導細胞免疫；IL-4是Th2細胞分泌的代表性因子，介導體液免疫。Th1/Th2細胞及其細胞因子具有相互抑制、相互調節(jié)效應,維持著動態(tài)平衡,對整個免疫系統(tǒng)的調節(jié)起著關鍵性的作用。近來IFN-γ與IL-4的比值，常作為研究Th1/Th2平衡的主要指標〔24～27〕。大量研究結果顯示,ACD患者急性期外周血Th1細胞水平低于健康人,而Th2細胞水平高于健康人,血清和皮損組織中呈現IL-4表達增高，而IFN-γ表達降低，提示ACD患者存在Th2 細胞占優(yōu)勢表達的Th1/Th2細胞亞群失衡狀態(tài)〔6,23〕。IFN-γ/IL-4的比例失衡,是ACD患者體內IgE合成過多的主要機制之一。

本研究結果提示電針對ACD小鼠有治療作用,尤其體現在止癢方面。作用機制可能是電針能通過下調P物質，促進IFN-γ分泌，從而對神經免疫網絡的調節(jié)，發(fā)揮治療作用。此外，本研究顯示電針對皮膚炎癥有一定的改善作用，但目前尚不能判斷是電針本身的抗炎作用，還是因為電針的止癢作用導致搔抓行為減少，從而起到對皮膚炎癥的控制作用，這也將是今后研究的重點。

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〔2015-12-10修回〕

(編輯曲莉)

國家自然科學基金青年基金項目(81403461)

符文彬(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事針灸治療痛癥及抑郁相關病癥研究。

蔣麗(1983-)，女，醫(yī)師，博士，主要從事針灸治療痛癥及抑郁相關病癥研究。

R758.22

A

1005-9202(2016)15-3615-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.003