任　攀　康群甫　劉衛(wèi)紅　周明學(xué)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院　北京市中醫(yī)研究所，北京　100010)

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·基礎(chǔ)研究·

復(fù)方普洱茶飲料對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈斑塊的干預(yù)作用及血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平的影響

任攀康群甫劉衛(wèi)紅周明學(xué)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京100010)

目的探討復(fù)方普洱茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)的ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(As)斑塊的干預(yù)作用及血清血栓素(TX)A2/前列環(huán)素(PG)I2比值和DNA甲基化水平的影響。方法將30只8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)6 w后隨機(jī)分為模型組、立普妥(陽(yáng)性對(duì)照組)和茶飲料組(n=10)，給予藥物干預(yù)6 w，另設(shè)正常組同品系小鼠(C57BL/6J家系)6只。檢測(cè)其血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、胰島素、TXA2、PGI2、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)水平和DNA甲基化水平。HE染色和VG染色，圖像分析測(cè)量小鼠主動(dòng)脈As斑塊面積、斑塊內(nèi)細(xì)胞外脂質(zhì)成分和膠原成分。結(jié)果與模型組相比，茶飲料組和立普妥組小鼠血清TC和TG水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高(均P<0.01),校正后主動(dòng)脈As斑塊面積、斑塊內(nèi)細(xì)胞外脂質(zhì)成分顯著降低(P<0.05)；小鼠血清DNA甲基化、DNMT及胰島素水平、小鼠血清TXA2水平顯著降低而血清PGI2水平顯著升高(均P<0.01)。結(jié)論復(fù)方普洱茶飲料可以降低血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平，從而達(dá)到抗ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈As斑塊的作用。

動(dòng)脈粥樣硬化；胰島素抵抗；血脂異常；茶飲料；DNA甲基化

由于人們生活水平的提高及生活方式的改變，高糖、高脂飲食攝入量增加，導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂以及胰島素抵抗，使動(dòng)脈粥樣硬化(As)的患病風(fēng)險(xiǎn)明顯上升〔1〕，而臨床上As患者常伴有血小板聚集狀態(tài)異常。新近研究表明，DNA甲基化是導(dǎo)致As和胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。既往研究表明普洱茶具有減肥、降脂和抗As的作用〔2～5〕。本實(shí)驗(yàn)以高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠為觀察對(duì)象，探討復(fù)方普洱茶飲料對(duì)脂質(zhì)代謝異常、胰島素抵抗和血小板凝集異常等的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑血清膽固醇檢測(cè)試劑盒(批號(hào)110821)、血清甘油三酯檢測(cè)試劑盒(批號(hào)110541)、血清低密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒(批號(hào)120531)、血清高密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒(批號(hào)120501)，均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。血清DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒(R&D公司，CK-E433652M，美國(guó))、VG染色試劑盒(福州市邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)：1312178002)。小鼠血清胰島素檢測(cè)試劑盒(R&D公司，CK-E20353M，美國(guó))、血清前列環(huán)素檢測(cè)試劑盒(R&D公司，CK-E10062M，美國(guó))，血清血栓素A2檢測(cè)試劑盒(R&D公司，CK-E11438M，美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物按重量計(jì)，普洱茶20～30份，山楂20～30份，白菊花10～20份，陳皮10～20份，烏梅10～20份，各味飲片均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。按10 g/100 ml的比例加入自來(lái)水，浸泡1 h；一煎煎出藥液100～150 ml，二煎煎出藥液70～100 ml；將兩次所煎藥液混勻，加入普洱茶，加熱浸泡10 min，然后將普洱茶濾出，將藥液濃縮至(67±5)ml，倒入100 ml試劑瓶中，密封4℃冰箱保存，注明熬制日期備用。阿托伐他汀鈣，商品名立普妥，上海輝瑞制藥公司，批號(hào)H20051408。

1.3動(dòng)物及分組6～8周齡ApoE-/-小鼠30只，品系C57BL/6J，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。高脂飼養(yǎng)6 w后，所有小鼠隨機(jī)分為模型組、立普妥組(陽(yáng)性對(duì)照組)3 mg/kg、茶飲料組405.5 mg/kg，每組10只。另設(shè)正常組同品系小鼠6只。所有給藥組劑量根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，并按成人與小鼠的給藥劑量換算系數(shù)折算成小鼠用量灌胃給藥，每日1次，灌胃給藥6 w。模型組給予等量的生理鹽水。高脂飼料配方為脂肪21%(wt/wt)、膽固醇0.15%的西方類(lèi)型膳食飼料。喂養(yǎng)12 w。各組動(dòng)物在喂養(yǎng)12 w后頸椎脫臼法處死，眶下靜脈叢取血，保留血清，無(wú)菌條件下取心臟，4%多聚甲醛固定。

1.4血清生化指標(biāo)檢測(cè)及動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)采用氧化酶法和直接法檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。采用ELISA法檢測(cè)血清胰島素水平、血清TXA2、PGI2和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)水平。采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)血清DNA甲基化水平。

1.5組織病理采用HE病理染色和IPP圖像軟件分析測(cè)量小鼠主動(dòng)脈As斑塊面積：測(cè)量管腔面積(LA,mm2)、內(nèi)彈力膜圍繞面積(IELa,mm2)，并計(jì)算斑塊面積、校正后斑塊面積。斑塊面積(PA,mm2)= IELa-LA。校正后斑塊面積 = PA/IELa；采用IPP圖片分析軟件測(cè)量小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)成分面積。校正后斑塊內(nèi)脂質(zhì)面積 =斑塊內(nèi)脂質(zhì)成分面積(LA,mm2)/PA(mm2)。采用VG染色和IPP圖像軟件分析主動(dòng)脈As斑塊內(nèi)膠原成分。校正后斑塊內(nèi)膠原面積 =斑塊內(nèi)膠原成分面積

(CA,mm2)/PA(mm2)。

1.6動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5軟件。計(jì)量資料組間比較在方差齊時(shí)用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1小鼠主動(dòng)脈As模型的復(fù)制高脂喂養(yǎng)12 w后，ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈出現(xiàn)典型的As斑塊，與正常組同品系C57小鼠相比，高脂飼料喂養(yǎng)12 w后的ApoE-/-小鼠(模型組)主動(dòng)脈管壁上可觀察到典型的富含膽固醇酯的As斑塊(圖1)，斑塊有成熟的纖維帽覆蓋。說(shuō)明復(fù)制As模型成功。

圖1　高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈與正常同品系小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)對(duì)比(HE，×200)

2.2茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠血清血脂水平和AI的影響采血后室溫放置1 h，3 500 r/min離心15 min后，血液分層。模型組小鼠上清液呈白色乳糜狀，立普妥組小鼠上清液與模型組比較略清澈，而茶飲料組小鼠血清更清澈。與模型組相比，茶飲料組和立普妥組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平明顯降低，小鼠血清HDL-C水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，茶飲料組和立普妥組小鼠AI均顯著降低(P<0.01)；兩給藥組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠血清血脂水平和AI的影響

與模型組比較：1)P<0.01；下表同

2.3茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠校正后主動(dòng)脈As斑塊面積的影響藥物干預(yù)6 w后，與模型組〔(38.63±10.39)mm2〕相比，立普妥組〔(19.04±8.88)mm2〕和茶飲料組〔(18.28±12.85)mm2〕小鼠的校正后主動(dòng)脈As斑塊面積顯著降低(P<0.05)，兩給藥組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2)。

2.4茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞外脂質(zhì)成分的影響藥物干預(yù)6 w后，與模型組〔(78.84±8.22)%〕相比，立普妥組〔(38.86±10.94)%〕和茶飲料組〔(21.68±4.59)%〕的校正后主動(dòng)脈As斑塊內(nèi)細(xì)胞外脂質(zhì)成分顯著降低(P<0.01)，兩給藥組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原成分的影響藥物干預(yù)6 w后，與模型組〔(45.12±6.67)%〕相比，立普妥組〔(13.60±8.57)%〕和茶飲料組〔(16.34±12.88)%〕的校正后主動(dòng)脈As斑塊膠原成分顯著降低(P<0.01)，兩給藥組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖2　茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的影響(×100)

圖3　茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原成分的影響(×100)

2.6茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠血清DNA甲基化水平和DNMT水平的影響藥物干預(yù)6 w后，與模型組〔(18.20±0.519 3)μmol/L,(88.44±3.308)U/L〕相比，立普妥組〔(13.40±0.952 4)μmol/L,(57.82±6.072)U/L〕和茶飲料組〔(8.518±0.391 8)μmol/L,(26.72±2.497)U/L〕小鼠血清DNA甲基化水平及DNMT水平顯著降低(P<0.01)，兩給藥組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.7茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠體重的影響與模型組相比〔(33.88±1.85)g〕，茶飲料組小鼠體重明顯降低〔(29.17±1.98)g〕(P<0.01)，并且優(yōu)于立普妥組〔(32.56±1.32)g〕(P<0.05)。

2.8茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠血清胰島素水平的影響藥物干預(yù)6 w后，與模型組〔(20.75±0.470 4)mIU/L〕相比，立普妥組〔(18.29±0.622 4)mIU/L〕和茶飲料組〔(18.37±0.286 2)mIU/L〕小鼠血清胰島素水平明顯降低(P<0.01)，兩給藥組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.9茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠血清TXA2、PGI2和TXA2/PGI2比值的影響藥物干預(yù)6 w后，與模型組相比，立普妥組和茶飲料組小鼠血清TXA2水平顯著降低，而血清PGI2水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，立普妥組和茶飲料組小鼠血清TXA2/PGI2比值顯著降低，兩給藥組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　茶飲料對(duì)高脂喂養(yǎng)12 w ApoE-/-小鼠血清TXA2、PGI2 和TXA2/PGI2比值的影響

3　討　論

胰島素抵抗作為As獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可引起脂質(zhì)代謝異常和炎癥反應(yīng)〔6〕,是連接多種代謝性疾病的中心環(huán)節(jié)〔7〕。臨床上As患者常伴有血小板聚集狀態(tài)異常。新近研究表明，DNA甲基化是導(dǎo)致As和胰島素抵抗發(fā)生的重要機(jī)制。既往研究表明普洱茶具有減肥、降脂和抗As的作用〔2～5〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)方普洱茶飲料可明顯減輕As小鼠體重和降低血清胰島素水平，并可通過(guò)調(diào)脂、改善血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平起到抗As的作用。

本研究中選用普洱茶、山楂、白菊花、陳皮和烏梅5種常見(jiàn)的茶飲食材。普洱茶溫和，具有暖胃、減肥、降脂的作用，其中的茶褐素可以減少內(nèi)臟脂肪的積累〔8〕。山楂具有開(kāi)胃消食、活血化瘀之功效，其提取物中的山楂總黃酮對(duì)不同動(dòng)物的高脂模型均有肯定的降脂作用，還可減少血小板在血管壁的聚集和血栓素的釋放；另外山楂還具有強(qiáng)心、降血壓的作用，適用于As和冠心病患者〔9〕。白菊花性涼，味甘苦，具有疏風(fēng)清熱、明目解毒的功效，可調(diào)整血脂。陳皮理氣開(kāi)胃、燥濕化痰、可減肥降脂，陳皮中類(lèi)黃酮和陳皮多糖具有顯著的降糖〔10〕、抗血小板聚集的作用〔11〕。烏梅斂肺、澀腸、生津、安蛔，可改善血脂和血壓。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方普洱茶飲料具有調(diào)脂、抗As以及潛在的改善胰島素抵抗和穩(wěn)定As斑塊的作用，而改善胰島素抵抗可能是中心環(huán)節(jié)。

PGI2主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，具有舒張血管和抑制血小板聚集的作用。TXA2主要由血小板微粒合成和釋放，其作用與PGI2相反，具有收縮血管和促進(jìn)血小板聚集的作用。TXA2/PGI2 之間的動(dòng)態(tài)平衡是調(diào)控血管壁緊張度、血小板功能及血管壁細(xì)胞遷移生長(zhǎng)的重要因素，PGI2/TXA2 平衡失調(diào)易導(dǎo)致血小板聚集、血栓形成。本研究結(jié)果提示復(fù)方普洱茶飲料在改善胰島素抵抗發(fā)揮抗As作用的同時(shí)還可能具有預(yù)防血栓形成的作用。

新近研究表明，DNA甲基化是導(dǎo)致As和胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。Kim等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)基因組甲基化水平與冠心病及冠心病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，而DNA甲基化程度的改變可導(dǎo)致胰島素抵抗〔3〕。本研究結(jié)果提示，復(fù)方普洱茶飲料可能通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠血清的整體DNA甲基化水平和DNMT水平影響其基因的甲基化水平，從而發(fā)揮改善胰島素抵抗和抗As的作用。

本研究結(jié)果表明，復(fù)方普洱茶飲料能夠抑制ApoE-/-小鼠As斑塊的形成和進(jìn)展，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)血脂，降低血清DNA甲基化水平和TXA2/PGI2比值等發(fā)揮抗As的作用。本實(shí)驗(yàn)中所用的藥材均采用常用食材，沒(méi)有毒副作用和不良反應(yīng)，值得進(jìn)一步研發(fā)。

1馬芳義，魏芳晶.胰島素抵抗與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2010;16(14):2112-4.

2Sharma P,Garg G,Kumar A,etal.Genome wide DNA methylation profiling for epigenetic alteration in coronary artery disease patients〔J〕.Gene,2014;541(1):31-40.

3Ling C,Del Guerra S，Lupi R，etal.Epigenetic regulation of PPARGC1A in human type 2 diabetic islets and effect on insulin secretion〔J〕.Diabetologia,2008;51(4):615-22.

4程春華,楊繼紅.普洱茶對(duì)apoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2012;32(15):3241-3.

5徐湘婷,王鵬,羅紹忠,等.普洱茶預(yù)防SD大鼠高脂血癥及抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮的研究〔J〕.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011;26(2):260-4.

6沈燕,黎紅華.胰島素抵抗導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究〔J〕.神經(jīng)損傷與功能重建,2012;7(5):377-9.

7DeFronzo RA.Insulin resistance,lipotoxicity,type 2 diabetes and atherosclerosis:the missing links.The Claude Bernard Lecture 2009〔J〕.Diabetologia,2010;53(7):1270-87.

8鄒曉菊,丁毅弘,梁斌.普洱茶減肥、降脂機(jī)制的探討〔J〕.動(dòng)物學(xué)研究,2012;33(4):421-6.

9吳士杰，李秋津，肖學(xué)風(fēng)，等.山楂化學(xué)成分及藥理作用的研究〔J〕.藥物評(píng)價(jià)研究，2010;33(4):316-8.

10趙秀玲.陳皮生理活性成分研究進(jìn)展〔J〕.食品工業(yè)科技,2013;34(12):376-81.

11吉中強(qiáng),宋魯卿,牛其昌.15種理氣中藥體外對(duì)人血小板聚集的影響〔J〕.中草藥,2001;32(5):46-8.

12Kim M,Long TI,Arakawa K,etal.DNA methylationasa biomarker for cardiovascular disease risk〔J〕.PLoS One,2010;5(3):e9692.

〔2016-06-30修回〕

(編輯曲莉)

Effects of compound Pu-erh Tea beverage on aorta atheromatous plaque and the levels of PGI2/TXA2 and DNA methylation in serum on atherosclerosis mice

REN Pan,KANG Qun-Fu,LIU Wei-Hong,et al.

Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University,Beijing institute of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100010,China

ObjectiveTo explore the effects of compound Pu-erh Tea beverage on aorta atheromatous plaque and on the levels of PGI2/TXA2 and DNA methylation in serum of atherosclerosis model mice.Methods30 male mice lacking ApoE gene were treated with high-fat diet for 7 weeks and then randomly divided into model,lipitor (Positive control group),Pu-erh Tea groups(n=10). Then the mice were treated with drugs for another 6 weeks. Moreover,6 C57BL/6J mice were as normal control. The levels of serum TC,TG,LDL-C,HDL-C,insulin,thromboxane A2(TXA2),prostacyclin I2 (PGI2),DNA methyltransferase (DNMT) and the DNA methylation were tested.ResultsCompared with those of model group,the levels of serum TC and TG were significantly reduced in Pu-erh Tea and lipitor groups,and the level of HDL-C was significantly increased (P<0.01),after adjustment,the area of aortic As plaque,the extracellular lipid composition were decreased significantly(P<0.05). The level of serum DNA methylation,DNMT,insulin,TXA2 were significantly decreased and PGI2 was significantly increased(P<0.01).ConclusionsCompound Pu-erh Tea beverage could significantly decrease the levels of TXA2/PGI2,DNA methylation,which maybe have an preventing effect on atherosclerosis ApoE-/-mice

Atherosclerosis;Insulin resistance;Dyslipidemia;Tea beverage;DNA methylation

國(guó)家自然科學(xué)基金課題(81303086)；北京市科技新星計(jì)劃課題(Z131107000413026)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才項(xiàng)目(2014-3-100)

周明學(xué)(1978-)，男，博士，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制和中醫(yī)藥防治研究。

任攀(1990-)，男，碩士，主要從事心血管疾病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)15-3609-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.001