楊文欣， 周 晗， 梁若龍， 胡巢鳳

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

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過(guò)表達(dá)Rip2對(duì)人胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡的影響*

楊文欣▲， 周 晗▲， 梁若龍， 胡巢鳳△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察受體相互作用蛋白2(Rip2)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡的影響。方法：采用JetPRIME試劑分別將pEGFP-C2和pEGFP-Rip2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Panc-1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、pEGFP-C2組和pEGFP-Rip2組。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細(xì)胞48 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測(cè)細(xì)胞Rip2水平及凋亡相關(guān)蛋白Bax、胞漿細(xì)胞色素c(Cyt-c)和Bcl-2蛋白表達(dá)；比色法檢測(cè)細(xì)胞caspase-3的活性。結(jié)果：轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2細(xì)胞Rip2蛋白表達(dá)明顯增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，pEGFP-Rip2組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組和pEGFP-C2組。與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-Rip2組的Bax和胞漿Cyt-c蛋白表達(dá)明顯升高，而B(niǎo)cl-2蛋白水平則顯著降低。并且，pEGFP-Rip2組細(xì)胞caspase-3活性明顯高于對(duì)照組和pEGFP-C2組。結(jié)論：過(guò)表達(dá)Rip2能誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與Rip2上調(diào)Bax以及胞漿Cyt-c蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白水平，增加caspase-3活性，從而激活內(nèi)源性凋亡途徑有關(guān)。

受體相互作用蛋白2； 細(xì)胞凋亡； Panc-1細(xì)胞

近年來(lái)的研究表明，NOD 樣受體(NOD-like receptors，NLRs)為胞漿內(nèi)的模式識(shí)別受體，可識(shí)別微生物高度保守相似的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮獨(dú)特的天然免疫功能。NLRs主要有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成：C末端是含有亮氨酸的重復(fù)序列，可識(shí)別病原相關(guān)分子模式；中間的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)；N末端是能與下游銜接蛋白銜接的結(jié)構(gòu)域[1-2]。受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，Rip2)是部分NLRs家族成員(如NOD1和NOD2等)信號(hào)通路的下游銜接分子，可激活NF-κB，促進(jìn)多種炎癥因子的產(chǎn)生[3-4]。McCarthy等[5]研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)Rip2能誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡，但其作用機(jī)制尚不清楚。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，Rip2對(duì)B 細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin’s lymphoma，B-NHL)細(xì)胞株Ramos細(xì)胞和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87MG具有明顯的促增殖作用，在Ramos細(xì)胞中，Rip2通過(guò)非經(jīng)典NF-κB通路的活化及可能協(xié)同經(jīng)典NF-κB通路參與NF-κB介導(dǎo)的抗凋亡作用[6]。這表明Rip2的作用具有細(xì)胞特異性，對(duì)細(xì)胞的生存和凋亡起著雙向調(diào)控的作用。國(guó)內(nèi)外對(duì)Rip2功能研究多集中在其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對(duì)其在凋亡中的作用及機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究過(guò)表達(dá)Rip2對(duì)人胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡的影響，并進(jìn)一步探討Rip2的作用機(jī)制，為臨床治療胰腺癌尋找新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

人胰腺癌細(xì)胞Panc-1由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)；pEGFP-C2空質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存物品；pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、PBS、青霉素和鏈霉素為含HyClone產(chǎn)品；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑JetPRIME購(gòu)自Polyplus；Annexin V-PE/7-AAD和caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biovision；Rip2多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品；Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)和GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；胎牛血清購(gòu)于Biological Industries；其它生化試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 Panc-1細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞采用10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)加入1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。以每孔7×104細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)將質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑JetPRIME加入培養(yǎng)板中，左右搖晃使其更加均勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后換新鮮的完全培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照(control)組: 培養(yǎng)細(xì)胞不做任何處理；pEGFP-C2組： pEGFP-C2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)； pEGFP-Rip2組：pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 每孔加入不含EDTA的胰酶，消化后用EP管小心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次。每管細(xì)胞加入200 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，再在每管細(xì)胞重懸液中加入5 μL Annexin V-PE，混勻后于室溫下避光孵育15 min。之后每管加入5 μL 7-AAD吹打混勻后即可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，染色后4 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 用含0.25% EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集Panc-1細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入100 g/L PMSF的細(xì)胞裂解液和1 μL PMSF蛋白酶抑制劑，吹打混勻，之后置于冰上孵育30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，收集上清。此外，收集各組細(xì)胞于EP管中。每管加入胞漿蛋白提取試劑A 80 μL，混勻后孵育20 min。然后每管加入胞漿蛋白提取試劑B 5 μL，混勻后16 000 r/min離心5 min，上清為要提取的胞漿蛋白。BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。

用SDS-PAGE分離蛋白后，將蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，再置于封閉液中進(jìn)行封閉1 h, 用特異性抗體檢測(cè)Rip2、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，以GAPDH作為蛋白內(nèi)參照。采用蛋白條帶灰度值來(lái)表示其相對(duì)表達(dá)量。

2.4 比色法測(cè)定caspase-3活性 收集各組細(xì)胞, 用PBS洗滌細(xì)胞1次，加入細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，冰上孵育15 min，取少量樣品測(cè)蛋白濃度。將50 μL細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)移到96孔板中，每孔加入含10 mmol/L DTT的2 × reaction buffer 50 μL及1 mmol/L (DEVD-pNA)5 μL?；靹蚝?7 ℃避光孵育2 h，在多功能酶標(biāo)儀400/405 nm處測(cè)定各孔吸光度(absorbance，A)值，根據(jù)樣品蛋白濃度計(jì)算出每一樣品的A值，再將該A值與對(duì)照組A值相比計(jì)算出各組細(xì)胞caspase-3的相對(duì)活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較用單因素方差分析(ono-way ANOVA)，組間均數(shù)兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組細(xì)胞形態(tài)變化

用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。如圖1所示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C2空質(zhì)粒后48 h，細(xì)胞形態(tài)和大小與對(duì)照組類似，細(xì)胞呈多角形，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)有明顯變化。轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒后48 h，可見(jiàn)部分細(xì)胞形態(tài)從多角形變成細(xì)長(zhǎng)形。

Figure 1.The changes of cellular morphology in different groups.

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)的變化

2 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后Rip2蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)細(xì)胞的Rip2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與control組和pEGFP-C2組比較，pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞48 h后Rip2蛋白的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而control組與pEGFP-C2組相比，Rip2蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述實(shí)驗(yàn)證明pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入Panc-1細(xì)胞并表達(dá)Rip2蛋白，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The protein expression levels of Rip2 in the Panc-1 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol and pEGFP-C2 groups.

圖2 各組Panc-1細(xì)胞Rip2蛋白的表達(dá)水平比較

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的細(xì)胞凋亡率

Annexin-V/7-AAD雙染后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的細(xì)胞凋亡率。Q3區(qū)表示活細(xì)胞，Q1區(qū)是壞死細(xì)胞，Q4區(qū)為早期凋亡細(xì)胞，Q2區(qū)代表晚期凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pEGFP-Rip2組的細(xì)胞凋亡率(Q2+Q4)明顯高于control組和pEGFP-C2組(P<0.01)；而control組與pEGFP-C2組比較，2組間細(xì)胞凋亡率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

4 Rip2對(duì)Panc-1細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與control組和pEGFP-C2組比較，pEGFP-Rip2組細(xì)胞的Bax和胞漿Cyt-c蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；而control組和pEGFP-C2組比較，Bax和胞漿Cyt-c蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，pEGFP-Rip2組細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于control和pEGFP-C2組(P<0.01)；而control組和pEGFP-C2組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 Rip2增加Panc-1細(xì)胞caspase-3的活性

與control組和pEGFP-C2組比較，pEGFP-Rip2組細(xì)胞caspase-3的活性明顯增高(P<0.01)；而control組和pEGFP-C2組相比，caspase-3活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

討 論

凋亡又稱細(xì)胞的程序性死亡，是在生理?xiàng)l件下發(fā)生的細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡與機(jī)體的生、老、病、死息息相關(guān)，是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要手段。當(dāng)遇到各種刺激時(shí)機(jī)體啟動(dòng)自殺保護(hù)措施，主動(dòng)清除功能異常的、多余的或者是與機(jī)體不相適應(yīng)的細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與死亡之間的平衡以達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的目的；一旦這種平衡被打破就會(huì)伴隨著各種疾病的發(fā)生。如凋亡受阻，某些細(xì)胞異常增殖，就會(huì)導(dǎo)致癌癥等疾病的發(fā)生；如凋亡過(guò)度，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性變等。

Figure 3.The effect of Rip2 overexpression on the apoptotic rate of Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol and pEGFP-C2 groups.

圖3 Rip2過(guò)表達(dá)對(duì)Panc-1細(xì)胞凋亡率的影響

Figure 4.The effect of Rip2 overexpression on the protein expression of Bax, cytoplasmic Cyt-c and Bcl-2 in the Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrot and pEGFP-C2 groups.

圖4 Rip2過(guò)表達(dá)對(duì)Panc-1細(xì)胞Bax、胞漿Cyt-c和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.Rip2 overexpression enhanced caspase-3 activity in the Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol and pEGFP-C2 groups.

圖5 Rip2過(guò)表達(dá)促進(jìn)Panc-1細(xì)胞caspase-3活性增強(qiáng)

Rip2屬于Rips家族的一員，大量文獻(xiàn)報(bào)道Rip2與固有免疫、適應(yīng)性免疫和炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系，其中也有報(bào)道其與細(xì)胞凋亡和增殖有關(guān)[7]。但是Rip2在不同細(xì)胞中具有促凋亡和抗凋亡的不同效應(yīng)，具有細(xì)胞特異性。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究Rip2是否促進(jìn)人胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡以及其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用了對(duì)細(xì)胞毒性小、操作簡(jiǎn)單而且轉(zhuǎn)染效率高的陽(yáng)離子聚合物JetPRIM試劑盒對(duì)Panc-1細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Rip2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒組的細(xì)胞Rip2蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組和pEGFP-C2組；而對(duì)照組與pEGFP-C2組比較，細(xì)胞Rip2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明pEGFP-Rip2質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入Panc-1細(xì)胞。由于本實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白，我們采用紅色熒光染料PE標(biāo)記的Annexin V與7-AAD雙染進(jìn)行流式術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。Annexin V-PE/7-AAD雙染時(shí)可用來(lái)區(qū)分存活的細(xì)胞、壞死細(xì)胞或早期和晚期凋亡細(xì)胞[8]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組和pEGFP-C2組；而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-C2組則對(duì)細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯影響。以上實(shí)驗(yàn)證明Rip2能誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡。Bax和Bcl-2都屬于Bcl-2家族成員，家族成員分兩類，一類是具有抗凋亡作用的蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL等，另外一類是具有促凋亡作用的蛋白，如Bax、Bak、Bid等。當(dāng)Bcl-2等抗凋亡分子的作用受到促凋亡分子的抑制，導(dǎo)致胞漿中Bax等被激活并定位于線粒體膜上，線粒體膜電位降低，使線粒體膜通透性改變，釋放促凋亡物質(zhì)，如Cyt-c，進(jìn)而激活下游的細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白酶caspase-3，激活內(nèi)源性凋亡途徑,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9-11]。本實(shí)驗(yàn)用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，在轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒組的細(xì)胞中Bax和胞漿Cyt-c蛋白水平明顯增高；而B(niǎo)cl-2蛋白水平顯著降低。同時(shí)，我們用比色法檢測(cè)了凋亡執(zhí)行蛋白酶caspase-3的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒組的caspase-3活性明顯高于對(duì)照組和pEGFP-C2組；而對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，caspase-3的活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，Rip2能夠誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡；其作用機(jī)制可能與Rip2上調(diào)Bax和胞漿Cyt-c蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，增加caspase-3活性，從而激活內(nèi)源性凋亡途徑有關(guān)。隨著進(jìn)一步探討Rip2的促凋亡作用機(jī)制，將為臨床治療胰腺癌及其它腫瘤尋找新的靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of Rip2 overexpression on apoptosis in human pancreatic cancer cell line Panc-1

YANG Wen-xin, ZHOU Han, LIANG Ruo-long, HU Chao-feng

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofPathophysiology,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thcf@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effect of receptor-interacting protein 2 (Rip2) overexpression on human pancreatic cancer cell line Panc-1. METHODS: pEGFP-C2 and pEGFP-Rip2 plasmids were respectively transfected into the Panc-1 cells using JetPRIME reagent. The cells were divided into control group, pEGFP-C2 group and pEGFP-Rip2 group. The apoptosis in the cells was detected 48 h after transfection by flow cytometry. Rip2 level and the expression of apoptosis-related proteins， Bax, cytoplasmic cytochrome c (Cyt-c) and Bcl-2， were analyzed by Western blot. The activity of caspase-3 was measured by colorimetric method. RESULTS: Rip2 protein expression significantly increased in the cells transfected with control and pEGFP-C2 plasmids. The apoptotic rate in pEGFP-Rip2 group was higher than that in control group and pEGFP-C2 group, whereas no significant difference of apoptotic rate was observed between control group and pEGFP-C2 group. The protein expression of Bax and cytoplasmic Cyt-c was remarkably increased and the protein expression of Bcl-2 was obviously decreased in pEGFP-Rip2 group as compared with control group and pEGFP-C2 group. The activity of caspase-3 in pEGFP-Rip2 group was obviously increased as compared with control group and pEGFP-C2 group. CONCLUSION: Overexpression of Rip2 is able to induce apoptosis in the Panc-1 cells， and the mechanism may be related to the up-regulation of Bax and cytoplasmic Cyt-c protein expression, down-regulation of Bcl-2 protein expression and enhancement of caspase-3 activity, thus activating intrinsic apoptotic pathway.

Receptor-interacting protein 2; Apoptosis; Panc-1 cells

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1584- 05

2016- 05- 01

2016- 08- 24

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2012010008161)

△通訊作者 Tel: 020-85228079； E-mail: thcf@jnu.edu.cn

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R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.009