章順榮， 高 越， 封 菲

(杭州市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310006)

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·短篇論著·

AGEs對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體融合蛋白表達(dá)的影響*

章順榮， 高 越△， 封 菲

(杭州市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310006)

目的： 明確晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是否可引起內(nèi)皮細(xì)胞線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2表達(dá)水平的變化。方法: AGEs用糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)代替。將購買的原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株進(jìn)行體外擴(kuò)增、傳代、分組，進(jìn)行AGEs干預(yù)，分為對(duì)照組，不同濃度梯度的AGEs干預(yù)組(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)和干預(yù)不同時(shí)間組(分別是100 mg/L的AGEs干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)AGEs干預(yù)后的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Mfn1和Mfn2的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測；采用Western blot法對(duì)AGEs干預(yù)后的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Mfn1和Mfn2的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果: 不同濃度AGEs干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h可引起Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低；100 mg/L AGEs干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞6 h，Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比無顯著變化，而干預(yù)12 h、24 h和48 h均引起人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論: AGEs干預(yù)體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞12 h后其線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2的表達(dá)水平降低，提示AGEs可能引起內(nèi)皮細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)的改變，并可能通過這一途徑引起內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能異常，而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常。

晚期糖基化終產(chǎn)物； 人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞； 線粒體動(dòng)力學(xué)； 線粒體融合蛋白

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白慢性非酶糖基化的產(chǎn)物，糖尿病患者、慢性腎功能不全患者以及老年人體內(nèi)AGEs的水平增高。AGEs與內(nèi)皮功能異常和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[1-2]，AGEs可引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生增加[3-4]。同時(shí)，最近研究表明線粒體動(dòng)力學(xué)的改變與內(nèi)皮功能異常密切相關(guān)[5]。線粒體不僅僅是能量工廠，尚能通過網(wǎng)架的動(dòng)態(tài)重構(gòu)、持續(xù)融合(fusion)和裂解(fission)來適應(yīng)細(xì)胞能量需求的變化，這一動(dòng)態(tài)改變過程被稱為線粒體動(dòng)力學(xué)。研究表明線粒體動(dòng)力學(xué)的改變與內(nèi)皮功能異常、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、衰老、退行性疾病，以及腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[6]。然而AGEs是否可影響內(nèi)皮細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)，從而通過這一途徑導(dǎo)致內(nèi)皮功能異常，目前國內(nèi)外尚未見有研究報(bào)導(dǎo)，是一個(gè)值得研究的靶點(diǎn)。

線粒體動(dòng)力學(xué)是線粒體融合和裂解動(dòng)態(tài)平衡的過程，涉及多種融合和裂解的關(guān)鍵蛋白，其中Mfn1和Mfn2分別是線粒體融合的2種關(guān)鍵蛋白[7]。本研究通過AGEs體外干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，來觀察AGEs是否可引起人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體融合關(guān)鍵蛋白Mfn1和Mfn2表達(dá)水平的變化，從而可能導(dǎo)致人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)的變化。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株和主要試劑

原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株購于武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。

糖基化牛血清白蛋白(advanced glycation end product-bovine serum albumin，AGE-BSA)購于Millipore；人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞特殊培養(yǎng)基購于武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒購自Generay；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas；qPCR試劑SuperReal PreMix Plus (with SYBR Green I)購自TIANGEN；anti-GAPDH antibody購自Bioworld；anti-Mfn1 antibody和anti-Mfn2 antibody購自 CST。

2 方法

2.1 人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和AGEs的干預(yù) 人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株接種于6孔板培養(yǎng)基，常規(guī)傳代，待內(nèi)皮細(xì)胞生長至約80%滿后換液，對(duì)照組繼續(xù)以含10%胎牛血清特殊培養(yǎng)液培養(yǎng)，而另外3組則在含10%胎牛血清的特殊培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的AGEs，使AGEs的終濃度分別為50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)液，PBS沖洗后，提取各組的總RNA和總蛋白，-20 ℃條件下保存，用于下一步研究。

另一批內(nèi)皮細(xì)胞按2×107/L濃度接種于含有載玻片的6孔板培養(yǎng)基，分為對(duì)照組和100 mg/L AGEs干預(yù)6 h、12 h、24 h、48 h組，共5組。待內(nèi)皮細(xì)胞生長至鋪滿80%玻片后換液，對(duì)照組繼續(xù)以含10%胎牛血清的特殊培養(yǎng)液培養(yǎng)，干預(yù)組則在培養(yǎng)液中加入終濃度為100 mg/L的AGEs，繼續(xù)分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h后去除培養(yǎng)液，PBS液沖洗后提取總蛋白和總RNA，-20 ℃條件下保存，用于進(jìn)一步研究分析。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Mfn1和Mfn2 mRNA的表達(dá)水平 以相應(yīng)溶劑為對(duì)照(blank組)，取2 μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280均>2.0且<2.3、觀察A260/A230比值及連續(xù)波長吸收峰，并計(jì)算RNA溶液濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測。Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)，各引物序列見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為IQ SYBR Green Supermix 10 μL，10 μmol/L的forward primer 1 μL， 10 μmol/L的reverse primer 1 μL，cDNA(加水稀釋成一致水平) 8 μL。Real-time PCR 條件為95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s、58 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件Bio-Rad CFX Manager自動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。

表1 Real-time PCR 引物序列

2.3 Western blot法檢測Mfn1和Mfn2的蛋白表達(dá)水平 采用 RIPA裂解液(含1.2 mmol/L的PMSF)裂解內(nèi)皮細(xì)胞，之后離心提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。上樣前樣品加入5×上樣緩沖液混勻，沸水中煮沸5 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道30 μg。50 mA恒流電泳至溴酚藍(lán)跑完濃縮膠層，分離膠電泳電流為60 mA；200 mA恒流轉(zhuǎn)膜；將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中，置搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉1 h。磷酸化抗體采用5% BSA 封閉，置搖床上緩慢搖動(dòng)室溫封閉1 h。取出已封閉的PVDF膜，加入Ⅰ抗4 ℃過夜后浸于TBST緩沖液中，于搖床上洗滌 15 min 3次；加入Ⅱ抗，于室溫?fù)u床上孵育1 h，洗膜同前，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。照片以TIFF格式導(dǎo)出后在ImageJ軟件下分析各條帶光密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件Bio-Rad CFX Manager自動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，并生成相應(yīng)的PDF文檔和Excel原始數(shù)據(jù)文件。運(yùn)用ImageJ 1.43圖像分析軟件對(duì)Western blot圖片進(jìn)行灰度掃描半定量分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AGEs引起人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2 mRNA的表達(dá)水平降低

1.1 不同濃度的AGEs干預(yù)HAECs，引起Mfn1和Mfn2 mRNA表達(dá)水平降低 如圖1所示，50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的AGEs干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后引起內(nèi)皮細(xì)胞Mfn1和Mfn2的mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。

Figure 1.The relative mRNA expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs stimulated with AGEs at different concentrations for 24 h. The relative mRNA expression levels were normalized to the GAPDH level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖1 不同濃度的AGEs干預(yù)HAECs 24 h引起Mfn1和Mfn2的mRNA表達(dá)水平降低

1.2 100 mg/L的AGEs干預(yù)HAECs 不同的時(shí)間，Mfn1和Mfn2 mRNA表達(dá)水平變化 如圖2所示，100 mg/L的AGEs分別干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h后，除了干預(yù)6 h組外，其余各不同干預(yù)時(shí)間組，內(nèi)皮細(xì)胞Mfn1和Mfn2的mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)。

2 AGEs引起人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2的蛋白表達(dá)水平降低

2.1 不同濃度的AGEs干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h引起Mfn1和Mfn2的蛋白表達(dá)水平降低 如圖3所示，Western blot法檢測結(jié)果顯示50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的AGEs干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后引起其Mfn1和Mfn2的蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。

2.2 100 mg/L的AGEs干預(yù)不同時(shí)間引起HAECs Mfn1和mfn2蛋白表達(dá)水平的降低 如圖4所示，Western blot法檢測結(jié)果顯示 100 mg/L的AGEs分別干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h后，除6 h干預(yù)組外，其余各不同時(shí)間干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞Mfn1和Mfn2的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均顯著下降(P<0.05)。

Figure 2.The relative mRNA expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs stimulated with 100 mg/L AGEs for different time intervals. The relative mRNA expression levels were normalized to the GAPDH level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖2 100 mg/L的AGEs干預(yù)HAECs 不同時(shí)間Mfn1和Mfn2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

Figure 3.AGEs at different concentrations (50 mg/L, 100 mg/L and 200 mg/L) downregulated the protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖3 不同濃度的AGEs干預(yù) HAECs 24 h引起Mfn1和Mfn2蛋白表達(dá)水平降低

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制涉及多種因素，特別是糖尿病患者，內(nèi)皮功能異常起著關(guān)鍵的作用。改善內(nèi)皮功能可延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，能改善相應(yīng)疾病(如冠心病、腦動(dòng)脈供血不足)癥狀和減少并發(fā)癥，是動(dòng)脈粥樣硬化防治的重要靶點(diǎn)之一。而線粒體功能障礙與心血管疾病關(guān)系密切[8]，線粒體動(dòng)力學(xué)不僅在維持線粒體的正常功能中起著關(guān)鍵作用，其異常改變與內(nèi)皮功能異常、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、衰老、退行性疾病，以及腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[6]。線粒體動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致內(nèi)皮功能異常，從而引起動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[9-10]。

Figure 4.The protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs stimulated with 100 mg/L AGEs for different time intervals. Except for 6 h intervention group, the protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in the HAECs for 12 h, 24 h, and 48 h were all downregulated. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

圖4 100 mg/L AGEs干預(yù)HAECs不同時(shí)間Mfn1和Mfn2的蛋白表達(dá)水平

AGEs與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，是糖尿病心血管并發(fā)癥的關(guān)鍵致病因子，可以引起血管內(nèi)皮功能異常。AGEs刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞能增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)、促凝血因子、組織因子、血小板與平滑肌細(xì)胞接觸，引起單核/巨噬細(xì)胞遷移，吞噬脂質(zhì)，啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程，促進(jìn)早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[11]。最近研究表明，AGEs能促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的自噬[12-13]。

但是AGEs是否通過影響線粒體動(dòng)力學(xué)，引起線粒體動(dòng)力學(xué)的異常，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能異常，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，目前國內(nèi)外尚未見研究報(bào)道，是一個(gè)值得研究的靶點(diǎn)。線粒體動(dòng)力學(xué)是融合和裂解動(dòng)態(tài)平衡的過程，正常情況下融合和裂解保持平衡，線粒體形態(tài)保持在管狀和顆粒狀之間，如融合增加則線粒體表現(xiàn)為長管狀形態(tài)，而裂解增加則表現(xiàn)為碎顆粒狀形態(tài)。裂解和融合過程涉及多種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白，Mfn1、Mfn2、OPA1參與融合過程，而Fis1、Drp1等參與裂解過程，此外，多種其它激酶參與了調(diào)節(jié)這一過程[14]。本研究采用AGEs干預(yù)體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)線粒體膜2種關(guān)鍵融合蛋白Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGEs干預(yù)能引起人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，AGEs的干預(yù)濃度從50 mg/L到200 mg/L，干預(yù)時(shí)間從12 h到48 h均能引起Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降。但AGEs干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞6 h，Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達(dá)水平未下降，這可能與干預(yù)時(shí)間過短、基因表達(dá)水平的改變尚未顯現(xiàn)有關(guān)。

一般認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞線粒體融合增加具有保護(hù)作用，具有維持正常線粒體功能和內(nèi)皮功能的作用，而裂解增加則引起線粒體功能異常、ROS的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致內(nèi)皮功能異常。例如，線粒體裂解蛋白Drp-1抑制劑Mdivi-1抑制線粒體的裂解能減輕壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心衰[15]和阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[16]，而過表達(dá)Mfn2則能抑制血管緊張素2引起的心肌肥厚[17]，外源性Mfn2基因的轉(zhuǎn)染能改善非酒精性脂肪肝細(xì)胞線粒體的功能、減少ROS的產(chǎn)生[18]。鑒于研究表明AGEs引起內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、損傷和凋亡，但是否通過影響線粒體動(dòng)力學(xué)這一機(jī)制而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和功能異常目前國內(nèi)外未見有研究報(bào)導(dǎo)。本研究初步表明，AGEs體外干預(yù)培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞引起線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2的表達(dá)水平降低，提示AGEs可能改變內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體動(dòng)力學(xué)，即線粒體的融合減少而線粒體的裂解增加，從而通過這一途徑引起內(nèi)皮細(xì)胞功能異常。

本研究也存在一定的不足之處，由于未采用牛血清白蛋白(BSA)干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作對(duì)照，因此不能完全排除高濃度的BSA可能會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)水平。但理論上講，血清白蛋白作為血清中的正常成分一般不會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞的正?；虮磉_(dá)水平，此外，內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中也有一定成分的胎牛血清。

總之，本研究表明AGEs可引起人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2的表達(dá)水平降低，提示AGEs可能引起線粒體的融合減少，從而通過這一途徑引起內(nèi)皮細(xì)胞功能異常。本研究對(duì)進(jìn)一步明確糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，可以揭示AGEs引起血管內(nèi)皮損傷的新機(jī)制，為糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of AGEs on expression of mitochondrial fusion proteins Mfn1 and Mfn2 in cultured human aortic endothelial cells

ZHANG Shun-rong, GAO Yue, FENG Fei

(GeriatricDepartment,HangzhouFirstPeople’sHospital,Hangzhou310006,China.E-mail:gy9821@sina.com.cn)

AIM: To clarify whether advanced glycation end products (AGEs) can influence the expression of mitochondrial fusion proteins Mfn1 and Mfn2 in cultured human aortic endothelial cells (HAECs)invitro. METHODS: AGE-BSA was used as AGEs. Purchased primary human aortic endothelial cell line was multiplied, and transferred to different passages for subsequent grouping. For dose-dependent experiment, HAECs were divided into 4 groups, and the concentrations of AGE-BSA in each group were 0 mg/L (control group), 50 mg/L, 100 mg/L and 200 mg/L, respectively. For time-dependent experiment, HAECs were divided into 5 groups with the same concentration (100 mg/L) of AGE-BSA, but the intervention time was 0 h (control group), 6 h, 12 h, 24 h and 48 h, respectively. The mRNA and protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in the HAECs were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. RESULTS: Exposure of the HAECs to AGEs at different concentrations for 24 h all down-regulated the mRNA and protein expression levels of Mfn1 and Mfn2. Except for 6 h intervention group, 100 mg/L AGEs intervention for 12 h, 24 h and 48 h all down-regulated the mRNA and protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs. CONCLUSION: AGEs down-regulates the expression of mitochondrial fusion proteins Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs, indicating that AGEs may influence mitochondrial dynamics of human aortic endothelial cells.

Advanced glycation end products; Human aortic endothelial cells; Mitochondrial dynamics; Mitochondrial fusion proteins

1000- 4718(2016)09- 1688- 06

2016- 01- 07

2016- 08- 03

杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.20120633B04)

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R543.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.026

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