謝益欣　王　敏　李先平　楊　敏　李碰玲　張婷婷　宋　歡　董智慧　唐愛國

(中南大學湘雅二醫(yī)院 檢驗科，長沙410011)

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金黃色葡萄球菌腸毒素C3過表達慢病毒載體的構建及鑒定①

謝益欣王敏李先平楊敏李碰玲張婷婷宋歡②董智慧②唐愛國

(中南大學湘雅二醫(yī)院 檢驗科，長沙410011)

目的：構建金黃色葡萄球菌腸毒素C3(SEC3)過表達慢病毒載體并體外檢測其表達目的基因。方法：聚合酶鏈反應(PCR)擴增SEC3基因片段；用AgeI 酶切線性化GV365慢病毒載體，通過連接反應構建GV365-SEC3載體，運用PCR方法鑒定陽性克隆載體；轉染293T細胞包裝慢病毒，觀察細胞熒光及Western blot檢測慢病毒載體表達，HIV-1 p24 ELISA法測定慢病毒載體滴度。結果：獲得目的基因，并成功構建GV365-SEC3慢病毒載體，通過PCR及DNA測序鑒定，證明GV365-SEC3質粒構建正確；轉染293T細胞后可觀察到大量熒光細胞，經蛋白電泳得到29 kD大小的蛋白條帶，與目的基因蛋白相符合，ELISA檢測病毒載體滴度為5×108TU/ml。結論：成功構建GV365-SEC3過表達慢病毒載體，為后期研究其體內外對抗腫瘤的作用與機制奠定基礎。

金黃色葡萄球菌腸毒素C3；慢病毒；載體構建；過表達

早在上世紀初伯內特提出了免疫監(jiān)視理論[1]，認為機體的免疫系統具有識別、殺傷并及時清除體內突變細胞，防止腫瘤發(fā)生的功能。當免疫監(jiān)視功能過低，無法有效清除突變細胞時，就可能發(fā)生腫瘤。腫瘤發(fā)生發(fā)展的根本原因之一是機體的免疫系統不能對其生長進行有效地控制[2-4]。腫瘤的傳統治療主要依靠手術、放療和晚期化療的方式，但療效并不理想，因此，尋找一種新的抗腫瘤治療的途徑和方法對腫瘤的治療很有必要。近年來，隨著針對免疫節(jié)點的單抗在臨床抗腫瘤中的成功使用，免疫療法在腫瘤治療中備受關注[5]，它包括非特異性免疫刺激劑、腫瘤疫苗、過繼性免疫細胞療法以及單抗治療等[6]。金黃色葡萄球菌腸毒素C(Staphylococc-us aureus enterotoxin，SEC)作為超抗原，可以多克隆活化T細胞，誘發(fā)強烈的細胞免疫應答[7,8]，是一種很好的免疫調節(jié)劑和細胞因子誘導劑，已成為抗腫瘤治療的一個重要方向。90年代以來，腫瘤治療的另一個熱點基因治療(Gene therapy)正逐步從實驗室進入臨床，到2012年全世界完成了超過1 800個臨床試驗，因此認為基因治療的核心概念是有用的，基因植入病人能安全的表達[9]。由于腫瘤是多基因、多因素導致的復雜疾病，單一因子或單一機制的療法對腫瘤的效果往往有限，若將兩者結合，通過持續(xù)大量地激活自身免疫細胞對腫瘤細胞進行有效殺傷成為極具潛力的抗腫瘤方法。本研究我們利用基因工程技術構建過表達SEC3基因的慢病毒載體，并進行體外轉染及鑒定，以期為進一步研究其生物學功能提供依據，并為后期研究其體內外對抗腫瘤的作用與機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器SEC3原核表達質粒為本室保存，慢病毒工具質粒載體GV365、病毒包裝輔助質粒(Helper 1.0和Helper 2.0)、293T細胞、大腸桿菌菌株DH5α購自上海吉凱基因有限公司，Primer均購自上海捷瑞公司，ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit購自Vazyme公司，Taq polymerase購自SinoBio公司，限制性內切酶購自NEB公司，Plasmid 抽提 Kit購自Promega公司，胎牛血清FBS和DMEM均購自Gibco，胰酶購自上?；瘜W試劑公司，Opti-MEM購自Invitrogen，Prestained protein marker購自中晶公司，ECL-PLUS/Kit購自Amersham公司，HIV-1 p24 antigen 和ELISA 試劑盒均購自北京達科為生物技術有限公司，PCR儀購自Applied Biosystem公司，DNA電泳儀購自BioRad公司，凝膠成像儀購自天能公司，超聲破碎儀購自上海豫明儀器公司，熒光顯微鏡為奧林巴斯公司產品。

1.2方法

1.2.1SEC3過表達慢病毒載體的構建

1.2.1.1目的基因的獲取設計基因引物如下：上游：5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATG-GAGAGTCAACCAGACCCTATGCCAGATG-3′;下游:5′-TCCTTGTAGTCCATACCTCCATTCTTTGTTGTAA-GGTG-3′(單劃線示：交換配對堿基及酶切位點，雙劃線示：表達增強序列以及目的基因5′端部分序列用于釣取目的基因)。PCR擴增釣取SEC3原核表達質粒的目的基因片段。

1.2.1.2GV365-SEC3載體的構建冰水浴中配置反應如下體系：PCR產物片段1 μl，經AgeⅠ/AgeⅠ酶切的線性化GV365載體2.5 μl，ddH2O 3.5 μl，5×CE Ⅱ Buffer 2 μl，ExnaseTMⅡ 1 μl共10 μl。于37℃反應30 min，隨后置于冰水浴中冷卻5 min，將交換產物加入到100 μl感受態(tài)細胞中，冰上放置30 min，42℃熱激90 s，冰水孵育2 min，加入500 μl LB培養(yǎng)基后，于37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h。取適量菌液均勻涂布在含有相應抗生素的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。

1.2.2GV365-SEC3載體的鑒定在平板上挑出其中8個菌落做PCR，鑒定引物為Ubi-F：GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG，FLAG-R-2：CCTTATAGTCCTTATCATCGTC，陽性對照為GAPDH內參基因，陰性對照以未插入目的基因的空載體為模板，凝膠電泳檢測擴增產物。挑取克隆陽性產物測序，與目的基因序列進行比對分析。最后將測序正確的菌液進行質粒抽提。

1.2.3GV365-SEC3慢病毒載體的包裝與檢測

1.2.3.1GV365-SEC3載體的轉染以DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)調整293T細胞密度約5×106細胞/15 ml，接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，待細胞密度達70%～80%時即可用于轉染。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(GV載體質粒20 μg、pHelper 1.0載體質粒15 μg、pHelper 2.0載體質粒10 μg)，與相應體積的吉凱轉染試劑混合均勻，調整總體積為1 ml，在室溫下溫育15 min。將混合液緩慢滴加至293T細胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后棄去培養(yǎng)基，并用PBS液洗滌，緩慢加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基20 ml，于37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)。轉染24 h后，在熒光顯微鏡下觀察質粒上熒光標記基因的表達情況以判斷感染效率，轉染36 h后收集細胞進行Western blot檢測。

1.2.3.2Western blot檢測慢病毒載體表達取出293T細胞，棄去細胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次將細胞裂解，離心，超聲破碎儀破碎細胞(200 W 共4次，每次5 s，間隔2 s)，于4℃、12 000 r/min離心15 min后取上清，測蛋白濃度，每個樣品蛋白終濃度均調整為20 μg，用10%分離膠，5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，80 V 2 h后在 4℃，400 mA 恒流條件下電轉120 min，將蛋白轉移到PVDF 膜上，最后行ECL免疫顯色，X光顯影。

1.2.3.3HIV-1 p24ELISA法測定慢病毒載體滴度準備一塊24孔板，將濃縮純化的病毒液稀釋105～107倍，將標準品按125、31.3、15.6、7.8 pg/ml，空白孔5個濃度稀釋，各取200 μl加入24孔板中，封板膜密封微孔板，37℃靜置1.5 h。350 μl Wash Buffer清洗微孔板4遍，每孔加入100 μl HIV-1 P24檢測抗體(對照孔除外)，封板后37℃靜止1 h，吸棄HIV-1 P24 檢測抗體，重復上述洗板過程，每孔加入100 μl底物，無需密封，室溫避光放置30 min，每孔加入100 μl終止液終止反應，15 min內，使用酶標儀測定A450，制作標準曲線，得到待測病毒滴度。

2　結果

2.1成功構建GV365-SEC3重組載體獲取目的基因，PCR后電泳得到765 bp長度的條帶 。通過連接反應成功構建GV365-SEC3重組載體后，用鑒定引物PCR結果表明Gene1-8號轉化子除Gene3號為陰性克隆外，其余7個轉化子均為陽性克隆(大小為960 bp)，電泳圖見圖1，將陽性轉化子進行測序及比對驗證，測序結果與目的基因序列完全一樣。

2.2包裝及制備慢病毒GV365-SEC3GV365-SEC3 重組載體、 pHelper 1.0及pHelper 2.0載體質粒體系共同轉染293T細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到細胞內可見明顯的GFP表達綠色熒光，見圖2，說明目的質?；虺晒D染到293T細胞并且表達正常。Western blot電泳圖見圖3，可以觀察到29 kD附近處有特征條帶，其大小和目的基因融合蛋白相吻合。

圖1　GV365-SEC3載體的酶切鑒定圖Fig.1　Restriction map of GV365-SEC3 vectorNote: 1.Negative control(ddH2O)；2.Negative control(empty vector interconnection);3.Positive control(GAPDH);4.Marker;5-12.Gene 1 to 8 transformants.

圖2　GV365-SEC3載體轉染293T細胞，綠色熒光與白光對照圖(×100)Fig.2　Green fluorescence picture and white light picture of transfected 293T cell by GV365-SEC3 vector(×100)Note: A.White light picture;B.Green fluorescence picture.

圖3　純化的SEC3蛋白電泳圖Fig.3　Electrophoretic profile of SEC3 purified proteinNote: 1.Marker SM0441;2.Positive control(WB standard:SURVIVIN-3FLAG-GFP,Molecular weight 48 kD);3.Negative control(293T cell);4.Target gene transfected 293T cells.

表1標準品及待測組吸光度值

Tab.1Absorbance value of standard and test viru groups

Standardconcentration(pg/ml)Absorbanceofparallelholes(OD450)123Averagevalue(OD450)Actualvalue(OD450)Actualconcentration(pg/ml)00.0530.0530.0540.05307.80.1490.1490.1490.1490.09515.60.2470.2470.2470.2470.19431.30.4110.4090.4120.4110.3571251.4521.4451.4581.4511.39810-7Dilution0.2860.2870.2840.2860.23220.110-6Dilution0.9870.9870.9870.9870.93483.2810-5Dilution1.9521.9521.9541.9531.899170.28

圖4　GV365-SEC3的ELISA標準曲線Fig.4　ELISA standard curve of GV365-SEC3

2.3慢病毒載體滴度的檢測用酶標儀測定A450對慢病毒滴度進行定量分析，得各組吸光度測定值見表1，制作標準曲線如圖4，GV365-SEC3樣品為10-7稀釋度時OD值為0.232，10-6稀釋度時OD值為0.934，10-5稀釋度時OD值為1.899，根據標準曲線以及ELISA試劑盒的病毒濃度與滴度的換算關系1 TU/ml=1 pg/ml，所得的病毒滴度為5×108TU/ml。

3　討論

據2012年全球腫瘤流行病統計數據(GLOBO-CAN2012)顯示：2012年全球新增約1 410萬例癌癥病例，癌癥死亡人數達820萬，較2008年增加。且全球一半以上癌癥新增病例和死亡人數發(fā)生在欠發(fā)達地區(qū)(http://globocan.iarc.fr/Defau-lt.aspx)。我國腫瘤登記中心也進行了最新的分析，數據顯示2012年全國新發(fā)腫瘤病例約358.6萬例，死亡病例218.7萬例，均有增加趨勢[10]，可見腫瘤是中國人口死亡的最主要原因，也已然成為全球主要的公共衛(wèi)生問題。

對于腫瘤的治療主要依靠手術、放療及化療三大傳統治療措施，但這些治療方法不良反應較多、效果欠佳。因此，努力尋找一種新型的腫瘤治療方法很有必要。

近年來腫瘤生物免疫治療如雨后春筍般蓬勃發(fā)展，2013年度Science雜志評選出的10大科技突破，居首位的也是“腫瘤免疫治療”[11]。腫瘤的免疫治療的靶細胞不是腫瘤細胞和組織，而是通過激發(fā)和增強自身的免疫功能，以達到控制和協助殺滅腫瘤細胞的目的。金黃色葡萄球菌腸毒素C3是一種細菌性超抗原，分子量為26～30 kD。它能直接與MHCⅡ類分子及TCR-β鏈的V區(qū)結合，無需抗原提呈細胞提呈便能活化的大量T細胞并分泌的大量細胞因子，對腫瘤細胞具有強大的殺傷作用，有望成為新一代抗腫瘤治療分子[12]。在我國，金黃色葡萄球菌濾液制劑作為腫瘤放化療治療的輔助藥物應用于臨床已有十余年，它的主要成分就是金黃色葡萄球菌腸毒素C[13]。目前對金黃色葡萄球菌腸毒素的研究主要是SEA、SEB、SEE及SEC2，很少有關于SEC3的研究。本課題組早期首次將SEC3基因克隆到表達質粒內并實現了可溶性表達，并對重組SEC3的生物學活性進行初步研究，結果表明重組SEC3蛋白具有良好促人外周血單個核細胞增殖活性，并能夠增強PBMC對腫瘤細胞的殺傷活性[14，15]，這說明重組SEC3蛋白具有良好的超抗原活性，可能用于抗腫瘤治療。

自1989年人類基因治療臨床試驗第一次被批準后，基因治療成為腫瘤治療的熱點，截止到 2014 年 7 月，全球共批準 2 076 項基因治療方案進入臨床試驗[16]，部分基因治療的成果還被Science 雜志入選為2009 年度十大突破之一[17]。這些都顯示出基因治療的蓬勃生機以及腫瘤基因治療在臨床治療的安全性。單純由體外表達的SEC3蛋白活化的T細胞有限且作用短暫，不能持久的對抗腫瘤細胞。若將SEC3目的基因整合到靶細胞內，利用靶細胞實現SEC3蛋白持續(xù)表達，不僅能活化大量T細胞產生細胞毒作用，并且能提高腫瘤細胞的免疫原性，達到抗腫瘤作用。本研究選用慢病毒作為基因治療載體，慢病毒是逆轉錄病毒的一種，可以感染分裂期細胞和非分裂期的細胞，相比于傳統的腺病毒載體，慢病毒感染宿主細胞后能將病毒基因組整合于宿主基因組中，實現長時間、穩(wěn)定表達外源目的基因，應用范圍廣。慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，且目前人們對慢病毒進行不斷的優(yōu)化以保證它的安全性[18]。利用同源重組的方法將目的基因SEC3連接到慢病毒工具載體上，在國內外首次構建了GV365-SEC3慢病毒載體，經過鑒定得到960 bp的陽性克隆質粒。將SEC3重組載體質粒與病毒包裝質粒共同轉染293T細胞進行包裝，熒光顯微鏡下可見大量持續(xù)表達的熒光，并成功表達了分子量為29 bp的目的基因融合蛋白，與金黃色葡萄球菌腸毒素C3的分子量相吻合，說明重組載體質粒整合到感染細胞后能良好表達。收集上清中包裝成功含目的基因的慢病毒，該慢病毒為“自殺”性病毒，感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒，屬于假型病毒?？捎糜谶M一步研究GV365-SEC3慢病毒過表達載體在體內外感染腫瘤細胞后的抗腫瘤效果，以及實現過表達后聯合T細胞對抗腫瘤細胞生物學活性，也可作為腫瘤疫苗持續(xù)刺激機體對腫瘤細胞的殺傷，有望成為一種新型的抗腫瘤基因治療方法，具有一定的前景。

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[收稿2016-02-19修回2016-04-17]

(編輯許四平)

Construction and identification of lentiviral vector over-expressing Staphyloco-ccus aureus enterotoxin C3

XIE Yi-Xin，WANG Min，LI Xian-Ping，YANG Min，LI Peng-Ling，ZHANG Ting-Ting，SONG Huan,DONG Zhi-Hui,TANG Ai-Guo.

Department of Laboratory Medicine，The Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410011，China

Objective:To construct the lentiviral vector over-expressing Staphylococcus aureus enterotoxin C3 and detect the expression of target gene in vitro.Methods: SEC3 gene were amplificatied by polymerase chain rcaction(PCR).The GV365 lentiviral vectors were digested by AgeⅠ enzyme,which was linked to SEC3 gene and then constructed the GV365-SEC3 lentiviral vetor.Positive clones of vectors were identificd by PCR.Then the positive lentiviral vectors were transfected into 293T cells for lentivirus package.The expression of lentiviral vectors was tested by observating cell fluorescence and Western blot.The virus titer was determined by HIV-1 p24 ELISA.Results: SEC3 gene was amplified and successfully bound to the GV365 lentivirus vectors.The sequences of the recombinant plasmid were confirmed correct by PCR and DNA scqucncing.A large mass of green fluorescent cells were observed after transfecting.And the resulting size of 29 kD protein band of protein electrophoresis,which was consistent with the target gene protein.Viral vector titer was 5×108TU/ml by ELISA detection.Conclusion: Lentiviral vector over-expressing Staphylococcus aureus enterotoxin C3 was successfully constructed,laid the foundation of observing its effect and mechanism against to tumor in vivo and in vitro for later research.

Staphylococcus aureus enterotoxin C3;Lentiviral;Vector construction;Over-expressing

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.017

謝益欣(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事臨床微生物和免疫學研究。

及指導教師：王敏(1976年-)，女，博士，副主任技師，主要從事臨床微生物學和免疫學研究，E-mail：wangmin0000@aliyun.com。

R730.54

A

1000-484X(2016)09-1323-05

①本文為國家自然科學基金(81470133)和湖南省科技計劃項目(2013SK3048)。

②中南大學湘雅醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，長沙410013。