王　揚(yáng)，　黎承楊△，　孫　春，　鄧耀良，　曾國(guó)華，　王　翔，　陶芝偉，　關(guān)曉峰

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 南寧 530021； 2廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510120)

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高鈣離子誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1和HMGB1*

王揚(yáng)1，黎承楊1△，孫春1，鄧耀良1，曾國(guó)華2，王翔1，陶芝偉1，關(guān)曉峰1

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 南寧 530021；2廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510120)

目的： 觀察體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞在高鈣離子環(huán)境下細(xì)胞損傷及炎性因子MCP-1和HMGB1的表達(dá)。方法: 體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)，使用CaCl2配制成不同鈣離子濃度的溶液作為刺激劑，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(正常培養(yǎng)液)、 Ca I組(5 mmol/L Ca2+液)、 Ca II組(10 mmol/L Ca2+液)和 Ca III組(15 mmol/L Ca2+液)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)至3 h、6 h、9 h時(shí)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。培養(yǎng)6 h時(shí)，采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行細(xì)胞凋亡染色，觀察各組細(xì)胞凋亡情況；同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法分別檢測(cè)各組細(xì)胞上清液過氧化氫(H2O2)和8-異前列烷(8-IP)濃度，微量酶標(biāo)儀法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)活性。此外，培養(yǎng)6 h時(shí)收集各組細(xì)胞，采用real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞MCP-1和HMGB1的mRNA表達(dá)情況；并收集各組細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)其MCP-1和HMGB1的含量。結(jié)果: 隨著細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣離子濃度的增加，細(xì)胞活力抑制率和細(xì)胞凋亡明顯增加。LDH活性、細(xì)胞上清液H2O2的濃度和8-IP的含量在Ca I 組、Ca II組和Ca III組均較正常對(duì)照組高(P<0.05)。real-time PCR的結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，3個(gè)鈣離子誘導(dǎo)組細(xì)胞MCP-1和HMGB1 的mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。此外，3個(gè)鈣離子誘導(dǎo)組細(xì)胞上清液MCP-1和HMGB1含量均較正常組高(P<0.05)。結(jié)論: 本研究結(jié)果提示，高鈣離子可誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)細(xì)胞高表達(dá)MCP-1和HMGB1。由MCP-1和HMGB1引發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是高鈣尿參與結(jié)石形成的重要機(jī)制。

高鈣尿； 人腎小管上皮細(xì)胞； MCP-1； HMGB1

腎結(jié)石是一種嚴(yán)重影響人類健康的常見病和多發(fā)病，目前發(fā)病機(jī)制仍未明確，有多種學(xué)說試圖從不同角度闡明結(jié)石的形成，但都存在不足。炎癥學(xué)說是近年來被學(xué)者重視的一種學(xué)說，已經(jīng)有大量的研究結(jié)果[1-5]提示草酸鈣腎結(jié)石的形成是一個(gè)炎癥過程，尿液中的多種成分(如高鈣尿、草酸和草酸鈣晶體)均可單獨(dú)或一同引起上皮損傷導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，這在草酸鈣結(jié)石形成中可能起重要的作用。我們前期的臨床研究[5]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在含鈣腎結(jié)石患者尿液中，炎性細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP)和高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)生成增多，但未發(fā)現(xiàn)尿鈣水平對(duì)這2個(gè)因子的生成有明顯的影響，考慮這可能是由于體內(nèi)存在多種因素相互干擾的結(jié)果。由于MCP-1和HMGB1作為重要炎性因子可能是結(jié)石形成過程炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]，而目前在結(jié)石領(lǐng)域尚缺乏相關(guān)的研究，因此，本實(shí)驗(yàn)觀察體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞在不同高鈣濃度環(huán)境下炎性因子MCP-1和HMGB1表達(dá)及對(duì)細(xì)胞損傷的影響。

材　料　和　方　法

1主要材料

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenyl indole，DAPI)細(xì)胞凋亡染色試劑盒(貝博生物公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒和過氧化氫(H2O2)試劑盒(南京建成生物公司)；8-異前列烷(8-isoprostane, 8-IP)試劑盒(Oxford Biomedical Research)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR 相關(guān)試劑，人MCP-1、HMGB1和GAPDH引物設(shè)計(jì)合成(TaKaRa)；MCP-1和HMGB1 ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司)。

2正常培養(yǎng)液、高鈣離子培養(yǎng)液的配制

正常培養(yǎng)液為Gibco DMEM/F12+10% 胎牛血清+1%雙抗。取6.66 g二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)配制成含0.3 mol/L Ca2+的母液，經(jīng)過高壓滅菌冷卻后用DMEM/F12稀釋成含5 mmol/L Ca2+、10 mmol/L Ca2+和15 mmol/L Ca2+的3種高鈣離子培養(yǎng)液。

3實(shí)驗(yàn)分組

使用CaCl2配制成不同鈣離子濃度溶液作為刺激劑，將體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)分為4組：正常對(duì)照組(正常培養(yǎng)液)、Ca I 組(5 mmol/L Ca2+液)、Ca II組(10 mmol/L Ca2+液)和Ca III組(15 mmol/L Ca2+液)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)至3 h、6 h、9 h時(shí)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。培養(yǎng)6 h時(shí)，采用DAPI進(jìn)行細(xì)胞凋亡染色，觀察各組細(xì)胞凋亡情況；同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法分別檢測(cè)各組細(xì)胞上清液H2O2和8-IP濃度，微量酶標(biāo)儀法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液LDH活性。此外，培養(yǎng)6 h時(shí)收集各組細(xì)胞，采用real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞MCP-1和HMGB1 的mRNA表達(dá)情況；并收集各組細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)其MCP-1和HMGB1的蛋白含量。

4主要方法

4.1MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞活力的抑制率取生長(zhǎng)良好的第 5代 HK-2細(xì)胞，以 2×107/L的密度接種于 96 孔板，細(xì)胞融合后，更換為不含胎牛血清的正常對(duì)照組、Ca I 組、Ca II組和Ca III組。每組設(shè) 10 個(gè)孔，3 h、6 h、9 h后，每孔加入 20 μL 的 MTT 溶液，37 ℃孵育 4 h 后，棄上清液，每孔加入 200 μL DMSO。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于 490 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度(absorbance，A)值。根據(jù)公式：細(xì)胞活力抑制率= 1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)計(jì)算抑制率。以濃度為橫軸，以抑制率為縱軸繪制細(xì)胞活力抑制曲線。

4.2DAPI細(xì)胞凋亡染色取生長(zhǎng)良好的第 5代 HK-2細(xì)胞，以 1×108/L 的密度接種于 24 孔板，細(xì)胞融合后，更換為不含胎牛血清的正常對(duì)照組、Ca I、Ca II和Ca III組。6 h后加入DAPI孵育15 min,洗凈后馬上在熒光顯微鏡下觀察。DAPI能與雙鏈DNA結(jié)合，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)核濃縮，染色加深或染色質(zhì)呈新月型聚集于核膜一邊甚至核碎裂成大小不等的凋亡小體。

4.3微量酶標(biāo)法測(cè)細(xì)胞上清LDH活性取生長(zhǎng)良好的第 5代 HK-2細(xì)胞，以 3×108/L 的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合后，加入含不同濃度鈣離子的培養(yǎng)液。6 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 500 r/min離心10 min后-80 ℃保存。按試劑盒說明操作測(cè)得A值并計(jì)算LDH的活性。

4.4ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液H2O2的濃度取生長(zhǎng)良好的第 5代 HK-2細(xì)胞，以 3×108/L 的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合后，加入含不同濃度鈣離子的培養(yǎng)液。6 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 500 r/min離心10 min后-80 ℃保存。按試劑盒說明操作測(cè)得A值并計(jì)算H2O2的濃度。

4.5ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液8-IP的含量取生長(zhǎng)良好的第 5代 HK-2細(xì)胞，以 3×108/L 的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合后，加入含不同濃度鈣離子的培養(yǎng)液。6h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 500 r/min離心10 min后-80 ℃保存。按試劑盒說明操作測(cè)得A值并計(jì)算8-IP的含量。

4.6Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞MCP-1和HMGB1的mRNA表達(dá)水平單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在6孔培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，按總RNA提取試劑盒操作說明步驟提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA的濃度。去基因組反應(yīng)：總RNA<1.0 μg，5× gDNA Eraser buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，42 ℃ 2 min。逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成采用20 μL體系(含去基因組反應(yīng)產(chǎn)物，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，RT Primer Mix 4.0 μL，5×PrimeScript buffer 2 4.0 μL，RNase-free dH2O 1.0 μL)37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。SYBR Green染料法進(jìn)行定量檢測(cè)。按試劑盒說明配制反應(yīng)體系，95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃34 s， 共40個(gè)循環(huán)。按以上體系以及條件分別測(cè)定待測(cè)樣本目的基因及內(nèi)參照的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本基因表達(dá)的差異。引物由TaKaRa公司使用Primer 5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)合成。 MCP-1的上游引物為5’-AGCAGCAAGTGTCCCAAAGA-3’，下游引物為5’-GGTGGTCCATGGAATCCTGA-3’，產(chǎn)物大小為103 bp；HMGB1的上游引物為5’-GATCCCAATGCACCCAAGAG-3’，下游引物為5’-TCGCAACATCACCAATGGAC-3’，產(chǎn)物大小為109 bp； GAPDH的上游引物為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，產(chǎn)物大小為138 bp。Real-time PCR產(chǎn)物最終經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

4.7ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液MCP-1和HMGB1的蛋白含量取生長(zhǎng)良好的第 5代 HK-2細(xì)胞，以 3×108/L 的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合后，加入含不同濃度鈣離子的培養(yǎng)液。6 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 500 r/min離心10 min后-80 ℃保存。按試劑盒說明操作測(cè)得A值。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，A值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得擬合方程，根據(jù)待測(cè)樣本A值求出其濃度。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件處理。當(dāng)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1細(xì)胞活力抑制率的變化

細(xì)胞活力的抑制率隨著鈣離子濃度的增加而增加。除Ca I組(3 h)外，其余各濃度鈣離子刺激組與對(duì)照組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The cell growth curve measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.

圖1MTT法計(jì)算的各組在不同時(shí)點(diǎn)的抑制率

2細(xì)胞凋亡情況

光學(xué)顯微鏡下觀察，HK-2細(xì)胞呈典型螺旋狀貼壁生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)液鈣濃度的增加，各組細(xì)胞在形態(tài)上未見明顯變化。經(jīng)過 DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察，隨著培養(yǎng)液鈣離子濃度的增加，各組凋亡細(xì)胞增多，見圖2。

3各組細(xì)胞上清液LDH的活性

對(duì)照組、Ca I 組、Ca II組和Ca III組各組細(xì)胞上清液的LDH活性隨鈣離子濃度增加而逐漸增加，分別為(16.67±4.43) U/L、(54.79±2.26) U/L、(74.47±6.02) U/L和(87.77±3.76) U/L，見圖3。

4各組細(xì)胞上清液H2O2濃度

對(duì)照組、Ca I 組、Ca II組和Ca III組各組細(xì)胞上清液H2O2濃度隨鈣離子濃度增加而逐增漸加，分別為(17.30±0.28) mmol/L、(19.10±0.33) mmol/L、(21.56±0.28) mmol/L和(24.30±0.16) mmol/L，見圖4。

Figure 2.DAPI staining for the cells in culture.

圖2DAPI染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

Figure 3.LDH activity in the media of cell culture. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3各組細(xì)胞上清液LDH的活性

Figure 4.Hydrogen peroxide concentration in the media of cell culture. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖4各組細(xì)胞上清液H2O2濃度

5各組細(xì)胞上清液8-IP濃度

對(duì)照組、Ca I 組、Ca II組和Ca III組各組細(xì)胞上清液8-IP濃度隨鈣離子濃度增加而逐漸增加，分別為(21.55±4.31) μg/L、(61.12±4.55) μg/L、(78.48±2.57) μg/L和(94.74±3.34) μg/L，見圖5。

Figure 5.8-isoprostane (8-IP) concentration in the media of cell culture. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖5各組細(xì)胞上清液8-IP濃度

6各組細(xì)胞MCP-1和HMGB1的mRNA表達(dá)量

MCP-1、HMGB1和GAPDH的real-time PCR擴(kuò)增曲線3期(基線期、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期)明顯，說明基因擴(kuò)增完整；而熔解曲線的主峰只有1個(gè)，無明顯雜峰，說明real-time PCR定量精確，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，各基因的real-time PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)的片段大小與理論片段大小相符，證明產(chǎn)物具有特異性。MCP-1和HMGB1的mRNA在Ca I 組、Ca II組和Ca III組中的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，兩個(gè)基因的表達(dá)水平在Ca II組中達(dá)到高峰，見圖6。

7各組細(xì)胞上清液MCP-1和HMGB1的蛋白含量

對(duì)照組、Ca I 組、Ca II組和Ca III組各組細(xì)胞上清液MCP-1蛋白濃度分別為(13.48±1.60) ng/L、(22.93±2.86) ng/L、(40.57±1.63) ng/L和(30.39±1.61) ng/L(P<0.05)，見圖7。對(duì)照組、Ca I 組、Ca II組和Ca III組各組細(xì)胞上清液HMGB1蛋白濃度分別為(138.17±5.99) ng/L、(181.82±4.54) ng/L、(346.81±20.26) ng/L和(223.15±16.00) ng/L(P<0.05)，見圖8。

Figure 6.Electrophoresis in 2% agarose gels of real-time PCR products and relative mRNA (2-ΔΔCt) expression of MCP-1 and HMGB1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖6各組MCP-1和HMGB1的mRNA表達(dá)情況

Figure 7.The concentrations of MCP-1 protein in the media. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖7各組細(xì)胞上清液MCP-1含量的變化

Figure 8.The concentrations of HMGB1 protein in the media. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖8各組細(xì)胞上清液HMGB1含量的變化

8相關(guān)性分析

采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)鈣離子誘導(dǎo)組中MCP-1水平和HMGB1水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.876(P<0.05)。

討　　論

腎結(jié)石在形成過程中，腎小管上皮細(xì)胞是暴露在高濃度的鈣離子、草酸、草酸鈣和/或磷酸鈣晶體中的。體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[6]，在高濃度鈣離子作用下，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷，并呈時(shí)間和濃度依賴性。高濃度鈣離子損傷上皮細(xì)胞的機(jī)制與草酸鈣晶體一致，與活性氧的大量形成有關(guān)[6]。本研究結(jié)果也證實(shí)，HK-2細(xì)胞在高鈣離子環(huán)境下細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞上清液LDH活性、過氧化氫濃度和8-IP含量增加，提示細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。研究發(fā)現(xiàn)[1]，高濃度的鈣離子、草酸、草酸鈣和/或磷酸鈣晶體刺激腎小管上皮細(xì)胞活性氧大量增加，激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)分子信號(hào)通路，包括轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)，細(xì)胞大量表達(dá)炎性因子(如MCP-1、IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α等)。炎性因子可導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥和纖維化，同時(shí)吸引炎性細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞)進(jìn)入腎間質(zhì)內(nèi)吞噬晶體，后者又可釋放活性氧和炎性因子，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[1-4]。上皮細(xì)胞損傷后繼發(fā)出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是參與結(jié)石形成的重要過程，是當(dāng)前結(jié)石基礎(chǔ)研究的關(guān)注點(diǎn)之一[1]。

體外研究發(fā)現(xiàn)草酸、草酸鈣、磷酸鈣、尿酸晶體均可促使腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1[2, 7-8]。對(duì)腎結(jié)石患者進(jìn)行活檢研究[9]發(fā)現(xiàn)，腎結(jié)石患者較健康對(duì)照組有更顯著的腎小管損傷，在結(jié)石相鄰的腎組織有MCP-1、IL-6 的mRNA表達(dá)，同時(shí)局部浸潤(rùn)的白細(xì)胞數(shù)與腎內(nèi)MCP-1和IL-6的mRNA表達(dá)水平相關(guān)。因此，MCP-1與結(jié)石形成可能有密切的關(guān)聯(lián)性。臨床研究[10]發(fā)現(xiàn)高鈣尿患者尿液MCP-1增多。我們近期的臨床研究[5]也發(fā)現(xiàn),與健康者比較,含鈣腎結(jié)石患者尿液中MCP-1的水平明顯增多，但根據(jù)患者尿鈣水平進(jìn)行分組比較，發(fā)現(xiàn)高鈣尿?qū)δ蛞篗CP-1的生成無明顯的影響?？紤]到高濃度鈣離子損傷上皮細(xì)胞的機(jī)制與草酸鈣晶體一致，但兩者沒有協(xié)同作用[6]，在體內(nèi)由于兩者的作用都可能存在，無法確定高鈣尿的作用。因此，我們建立體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察單一因素(高鈣尿)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞生成MCP-1的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高鈣離子環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞大量表達(dá)MCP-1，此結(jié)果證實(shí)高鈣尿能直接刺激MCP-1的生成，而MCP-1的主要作用是趨化單核/巨噬細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織。尚有研究發(fā)現(xiàn)，由體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞、近端小管上皮細(xì)胞和牛的腎小球上皮細(xì)胞所生成的細(xì)胞因子中，具有趨化單核細(xì)胞作用的大約70%～80%來自MCP-1[1]。因此，高鈣尿刺激腎小管上皮細(xì)胞MCP-1生成在結(jié)石形成過程中的作用值得進(jìn)一步研究。

本研究觀察的另一個(gè)重要細(xì)胞因子HMGB1是一類在真核細(xì)胞中含量豐富的非組蛋白核蛋白，廣泛分布于真核細(xì)胞淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織中，在核內(nèi)核外都有重要的作用。在細(xì)胞核內(nèi)能夠參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程，而在體外卻有強(qiáng)大的促進(jìn)炎癥的作用[11]。HMGB1作為一種晚期炎癥因子可以來源于多種炎癥細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。HMGB1能夠主動(dòng)分泌也能被動(dòng)釋放，其主要來源是壞死的細(xì)胞[12]。胞外HMGB1可以和位于多種細(xì)胞表面的晚期糖基化末端產(chǎn)物受體結(jié)合，激活細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶途經(jīng)，并活化NF-κB，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。單核/巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和垂體細(xì)胞在內(nèi)毒素或炎癥因子刺激下均能分泌HMGBl[13]。近年研究[14]發(fā)現(xiàn)，HMGB1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞在體外和體內(nèi)注射后均有趨化作用。單核巨噬細(xì)胞可在腎臟內(nèi)晶體沉積周圍出現(xiàn)，吞噬晶體并釋放活性氧和炎性因子，參與炎癥反應(yīng)[1-4]。我們近期的研究[5]首次發(fā)現(xiàn)HMGB1在含鈣腎結(jié)石患者尿液中表達(dá)增多。因此，HMGB1在結(jié)石形成過程的炎癥反應(yīng)中可能起重要的作用[5]。由于體內(nèi)可能存在多種刺激HMGB1生成的因素，為此我們進(jìn)行了本次體外研究，結(jié)果證實(shí)高鈣離子在體外可單獨(dú)刺激腎小管上皮細(xì)胞HMGB1的生成。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腎結(jié)石的形成過程中有多種炎性因子的參與，形成了復(fù)雜的炎性網(wǎng)絡(luò)，這些炎性因子的關(guān)聯(lián)性值得深入研究。我們注意到NF-κB激活在MCP-1基因的調(diào)控方面起作用。在實(shí)驗(yàn)性高草酸尿動(dòng)物模型研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NF-κB的激活可以促進(jìn)MCP-1的表達(dá)[15]。已經(jīng)知道活性氧是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)器,其生成過度能激活NF-κB誘導(dǎo)炎癥[16],而草酸鈣腎結(jié)石形成與活性氧關(guān)系密切[1]，草酸和草酸鈣晶體刺激腎小管上皮生成MCP-1正是通過活性氧所介導(dǎo)的[7-8]。HMGB1能夠通過結(jié)合RAGE而激活NF-κB，啟動(dòng)炎癥過程[17]。HMGB1可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞促炎介質(zhì)的表達(dá)，包括MCP-1和多種細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)[18-19]。使用抗HMGB1中和抗體治療動(dòng)脈硬化病變，可以減少巨噬細(xì)胞的集聚和減少近72%的MCP-1的表達(dá)[14]。在研究肉芽腫腎炎時(shí)已經(jīng)證實(shí)，在體外HMGB1也能夠促進(jìn)大鼠腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1[20]。由此可見，炎性因子MCP-1和HMGB1生成之間存在密切聯(lián)系?？梢约僭O(shè)，在高鈣尿等病理環(huán)境下腎小管上皮HMGB1生成增多，活化NF-κB，調(diào)控MCP-1生成增多，從而有助于結(jié)石的形成。由于體內(nèi)存在多種損傷及保護(hù)因素的干擾，我們前期的臨床研究[5]結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)HMGB1與MCP-1之間的關(guān)聯(lián)性。因此，我們建立體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察在高鈣尿這單一因素的作用下，HK-2細(xì)胞表達(dá)兩個(gè)炎性因子的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)炎性因子的生成伴隨著活性氧的增加，HMGB1與MCP-1的生成與鈣離子濃度增加呈正相關(guān)，提示在高鈣離子環(huán)境下，HMGB1與MCP-1的生成通過活性氧所介導(dǎo)，兩個(gè)因子的生成存在著一定關(guān)聯(lián)，但兩個(gè)因子之間的關(guān)聯(lián)是通過何種激活通路來完成的，尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，高鈣離子可誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞高表達(dá)炎性細(xì)胞因子MCP-1和HMGB1。研究結(jié)果提示，由MCP-1和HMGB1引發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是高鈣尿參與結(jié)石形成的重要機(jī)制，但兩因子之間的關(guān)聯(lián)性是通過何種激活通路來完成的，尚有待進(jìn)一步研究。

[1]Khan SR. Reactive oxygen species, inflammation and calcium oxalate nephrolithiasis[J]. Transl Androl Urol, 2014, 3(3):256-276.

[2]Umekawa T, Chegini N, Khan SR. Increased expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) by renal epithelial cells in culture on exposure to calcium oxalate, phosphate and uric acid crystals[J]. Nephrol Dial Transplant, 2003, 18(4):664-669.

[3]Khan SR. Crystal-induced inflammation of the kidneys: results from human studies, animal models, and tissue-culture studies[J]. Clin Exp Nephrol, 2004, 8(2):75-88.

[4]Okada A, Yasui T, Fujii Y,et al. Renal macrophage migration and crystal phagocytosis via inflammatory-related gene expression during kidney stone formation and elimination in mice: detection by association analysis of stone-related gene expression and microstructural observation[J]. J Bone Miner Res, 2010, 25(12):2701-2711.

[5]孫春，黎承楊，鄧耀良，等. 尿鈣對(duì)含鈣腎結(jié)石患者尿液MCP-1、TFF1及HMGB1生成的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2015, 36(13):2017-2021.

[6]Khaskhali MH, Byer KJ, Khan SR. The effect of calcium on calcium oxalate monohydrate crystal-induced renal epithelial injury[J]. Urol Res, 2009, 37(1): 1-6.

[7]Habibzadegah-Tari P, Byer KG, Khan SR. Reactive oxygen species mediated calcium oxalate crystal-induced expression of MCP-1 in HK-2 cells[J]. Urol Res, 2006, 34(1):26-36.

[8]Habibzadegah-Tari P, Byer K, Khan SR. Oxalate induced expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in HK-2 cells involves reactive oxygen species[J]. Urol Res, 2005, 33(6):440-447.

[9]Boonla C, Hunapathed C, Bovornpadungkitti S, et al. Messenger RNA expression of monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-6 in stone-containing kidneys[J]. BJU Int, 2008, 101(9):1170-1177.

[10]Santos AC Jr, Lima EM, Penido MG ,et al. Plasma and urinary levels of cytokines in patients with idiopathic hypercalciuria[J]. Pediatr Nephrol, 2012, 27(6):941-948.

[11]Magna M, Pisetsky DS. The role of HMGB1 in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases[J]. Mol Med, 2014, 20(1):138-146.

[12]Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J]. Nature, 2002, 418(6894):191-195.

[13]Chen GQ, Ward MF, Sama AE, et al. Extracellular HMGB1 as a proinflammatory cytokine[J]. J Interf Cytok Res, 2004, 24(6):329-333.

[14]Kanellakis P, Agrotis A, Kyaw TS,et al. High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(2):313-319.

[15]Toblli JE, Cao G, Casas G, et al. NF-κB and chemokine-cytokine expression in renal tubulointerstitium in experimental hyperoxaluria. Role of the renin-angiotensin system[J]. Urol Res, 2005, 33(5):358-367.

[16]Gill R, Tsung A, Billiar T. Linking oxidative stress to inflammation: Toll-like receptors[J]. Free Radic Biol Med, 2010, 48(9):1121-1132.

[17]Park JS, Svetkauskaite D, He Q, et al. Involvement of toll-like receptors 2 and 4 in cellular activation by high mobility group box 1 protein[J]. J Biol Chem, 2004, 279(9):7370-7377.

[18]Fiuza C, Bustin M, Talwar S, et al. Inflammation-promoting activity of HMGB1 on microvascular endothelial cells[J]. Blood, 2003, 101(7):2652-2660.

[19]Andersson U, Wang H, Palmblad K,et al. High mobility group 1 protein (HMG-1) stimulates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes[J]. J Exp Med,2000,192(4):565-570.

[20]Oyama Y, Hashiguchi T, Taniguchi N, et al. High-mobility group box-1 protein promotes granulomatous nephritis in adenine-induced nephropathy[J]. Lab Invest, 2010, 90(6):853-866.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Increases in MCP-1 and HMGB1 production in HK-2 cells exposed to high level of calcium in vitro

WANG Yang1, LI Cheng-yang1, SUN Chun1, DENG Yao-liang1, ZENG Guo-hua2, WANG Xiang1, TAO Zhi-wei1, GUAN Xiao-feng1

(1DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China；2DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:assheep@163.com)

AIM: To investigate the effect of high level of calcium on the expression of inflammatory cytokines MCP-1 and HMGB1 in human kidney epithelial HK-2 cells. METHODS: Cultured HK-2 cells were divided into control group (normal media), CaⅠgroup (5 mmol/L Ca2+media), CaⅡgroup (10 mmol/L Ca2+media) and Ca Ⅲ group (15 mmol/L Ca2+media). The cells were incubated with or without additives for 3 h, 6 h and 9 h, and the cell activity was measured by MTT assay. At 6 h, DAPI staining was used to observe the cell apoptosis. LDL activity, H2O2content and 8-isoprostane (8-IP) concentration in the media were determined by microplate reader microfiltration and ELISA. The mRNA expression of MCP-1 and HMGB1 in the cells were determined by real-time PCR, and the protein levels of MCP-1 and HMGB1 in the media were measured by ELISA. RESULTS: The results of MTT assay showed that the inhibition rate of cell activity increased significantly with the increase in calcium concentration in the media. The results of DAPI staining showed that the apoptotic cells increased with the increase in calcium concentration in the media. The LDL activity, H2O2content and 8-IP concentration in the media all increased in accordance with the increased concentrations of calcium supplemented. Compared with control group, the mRNA expression of MCP-1 and HMGB1 in the HK-2 cells increased significantly in the 3 calcium supplemented groups (P<0.05). The protein levels of MCP-1 and HMGB1 in the media of Ca I, Ca II and Ca Ⅲ groups were significantly increased compared with control group (P<0.05). CONCLUSION: The production of MCP-1 and HMGB1 in the HK-2 cells exposed to high level of calcium is significantly increased, in accordance with the oxidative cell injury.

Hypercalciuria; Human renal epithelial cells; MCP-1; HMGB1

1000- 4718(2016)04- 0726- 07

2015- 11- 18

2016- 01- 28

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2011GXNSFA018177)；廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(No. 2010A060801016)

Tel: 0771-5356516; E-mail: assheep@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.024

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