許宏敏

(天津市第三中心醫(yī)院，天津　300170)

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CARD9在老年急性胰腺炎發(fā)病早期階段的作用

許宏敏

(天津市第三中心醫(yī)院，天津300170)

目的探討CARD9在老年急性胰腺炎發(fā)病早期階段的作用機(jī)制。方法選取98例老年急性胰腺炎患者，其中66例為輕癥急性胰腺炎(MAP)、32例為重癥急性胰腺炎(SAP)，入院后第1、3、5天分別收集外周靜脈血；選取40名健康志愿者為對(duì)照組，入組時(shí)收集外周靜脈血。密度梯度法離心分離單個(gè)核細(xì)胞；Western印跡檢測急性胰腺炎患者單個(gè)核細(xì)中CARD9、Bcl-10表達(dá)水平和p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平；免疫共沉淀法和免疫熒光檢測對(duì)照組、MAP組、SAP組入院第1天的CARD9、Bcl-1共定位、表達(dá)、結(jié)合情況。結(jié)果SAP組入院第1天的p65 NF-κB水平明顯高于對(duì)照組和MAP組第1、3、5天(P<0.05)；SAP組入院第3天的p65 NF-κB水平明顯高于對(duì)照組和MAP組第3、5天(P<0.05)。SAP組入院第1、3天的p38 MAPK水平明顯高于對(duì)照組和MAP組第1、3、5天(P<0.05)。SAP組入院第1、3、5天的CARD9、Bcl-10水平分別高于對(duì)照組和MAP組第1、3、5天(P<0.05)。治療后MAP組入院第5天的CARD9水平明顯低于第1天(P<0.05)。以IgG為陰性對(duì)照，SAP組灰度值明顯高于MAP組和對(duì)照組(P<0.05)。SAP組CARD9、Bcl-10共表達(dá)細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度均明顯高于MAP組和對(duì)照組；MAP組高于對(duì)照組，且第5天熒光強(qiáng)度與第1天相比明顯降低；SAP組第5天熒光強(qiáng)度仍明顯高于MAP組和對(duì)照組。p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平與CARD9表達(dá)呈正相關(guān); p38 MAPK磷酸化水平與CARD9表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論CARD9在老年急性胰腺炎疾病中通過激活NF-κB、MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生。

急性胰腺炎；CARD9；NF-κB；MAPK

老年急性胰腺炎(AP)患者病情有快速發(fā)展為重癥的可能性，導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，目前臨床仍缺乏有效的積極干預(yù)措施。研究已證實(shí)，單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活是AP發(fā)展的啟動(dòng)因子〔1〕。巨噬細(xì)胞中CARD9是一種高表達(dá)的新型銜接蛋白，可抵抗細(xì)菌和真菌感染，通過Bcl-10形成復(fù)合物激活下游核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路〔2〕。在大鼠模型中可通過抑制NF-κB和p38信號(hào)傳導(dǎo)因子減輕重癥AP(SAP)的嚴(yán)重程度〔3〕。CARD9在AP發(fā)病早期表達(dá)上升，但其在AP中的作用仍未明確。因此，本研究檢測老年AP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CARD9、Bcl-10表達(dá)水平，同時(shí)檢測CARD9下游信號(hào)分子p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平，探討其相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年10月至2015年10月本院收治的98例老年AP患者。其中66例為輕癥急性胰腺炎(MAP)，男30例，女36例，年齡60～74〔平均(67.14±3.50)〕歲。32例為SAP，男22例，女10例，年齡60～76〔平均(68.53±4.15)〕歲。均給予抑制胰酶分泌、補(bǔ)液、禁食等常規(guī)治療，選擇性給予抗感染治療。選取40名健康志愿者為對(duì)照組，男18例，女22例，年齡60～75〔平均(66.79±3.86)〕歲。三組患者性別構(gòu)成、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。所有入選受試者均簽署知情同意書；均無自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、惡性腫瘤等對(duì)檢測指標(biāo)有影響的疾病。

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞分離和蛋白提取患者入院第1、3、5天分別抽取肘靜脈血5 ml，對(duì)照組入組時(shí)取肘靜脈血5 ml，收集到的血液標(biāo)本均在6 h內(nèi)完成單個(gè)核細(xì)胞分離。密度梯度法離心分離單個(gè)核細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，使用總組蛋白提取試劑盒(上海拜力生物科技有限公司)提取蛋白：每份單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中加入100 μl裂解緩沖液，冰上充分裂解，10 000 r/min離心60 s，棄上清后加入50 μl裂解緩沖液，冰上充分裂解，10 000 r/min離心5 min，取上清，-20℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3Western印跡檢測檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中CARD9、Bcl-10表達(dá)水平和p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平。50 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳分離，半干法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉PVDF膜60 min，加一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液TBST洗膜3次，10 min/次，加二抗(1∶1 000稀釋)，室溫下孵育60 min，清洗后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4免疫共沉淀取0.2～500.0 μl總蛋白樣本加入2 μg兔多克隆抗體Bcl-10，4℃搖床過夜；加入20 μl混懸完全的蛋白A+瓊脂糖G，4℃搖床5 h。10 000 r/min離心10 min，棄去上清；PBS洗滌沉淀3次，棄去上清，SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，重懸沉淀。水浴5 min，取部分樣品行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，鼠單抗CARD9為一抗，行Western印跡檢測。用1 μg普通IgG和20 μl混懸完全的蛋白A+瓊脂糖G重復(fù)上述操作，作為陰性對(duì)照。用外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取的總蛋白重復(fù)上述操作，作為陽性對(duì)照。

1.5免疫熒光檢測檢測CARD9、Bcl-10共定位和表達(dá)情況。外周血單個(gè)核細(xì)胞用0.02 mol/L PBS混懸、離心，棄去上清，加200 μl的PBS混懸，取50 μl置于防脫載玻片，室溫下靜置備用。4%多聚甲醛溶液固定，PBS洗滌后加一抗(CARD9、Bcl-10抗體)，4℃孵育過夜。PBS洗滌后加熒光二抗〔CARD9抗體為羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)、Bcl-10抗體為羊抗兔HRP〕，4℃孵育60 min，封片后熒光顯微鏡拍攝。綠色熒光：CARD9圖像；紅色熒光：Bcl-10圖像；藍(lán)色熒光：細(xì)胞核圖像；黃色熒光：CARD9與Bcl-10融合圖像。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，相關(guān)性進(jìn)行Pearson分析。

2　結(jié)　果

2.1磷酸化p65 NF-κB、p38 MAPK水平三組p65 NF-κB、p38 MAPK水體總體比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。SAP組入院第1天的p65 NF-κB水平明顯高于對(duì)照組和MAP組第1、3、5天(P<0.05)；SAP組入院第3天的p65 NF-κB水平明顯高于對(duì)照組和MAP組第3、5天(P<0.05)。SAP組入院第1、3天的p38 MAPK水平明顯高于對(duì)照組和MAP組第1、3、5天(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1　Western印跡檢測三組各研究指標(biāo)蛋白表達(dá)

組別nCARD9Bcl-10磷酸化p65NF-κB磷酸化p38MAPK對(duì)照組400.34±0.051.13±0.221.28±0.220.69±0.35MAP組66入院第1天0.72±0.031)1.26±0.141.39±0.280.97±0.13入院第3天0.56±0.081.18±0.181.17±0.250.88±0.20入院第5天0.26±0.101.12±0.150.98±0.180.84±0.31SAP組32入院第1天1.13±0.061)2)1.85±0.171)2)1.75±0.061)3)1.99±0.161)2)入院第3天1.05±0.041)2)1.83±0.201)2)1.66±0.041)3)1.79±0.221)2)入院第5天1.02±0.021)2)1.71±0.251)2)1.49±0.251.37±0.45

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與MAP組同時(shí)間點(diǎn)相比：2)P<0.05；與SAP組同時(shí)間點(diǎn)相比：3)P<0.05

2.2CARD9、Bcl-10表達(dá)水平比較三組CARD9、Bcl-10水平總體比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。SAP組入院第1、3、5天

的CARD9、Bcl-10水平分別高于對(duì)照組和MAP組第1、3、5天(P<0.05)。治療后MAP組入院第5天的CARD9水平明顯低于第1天(P<0.05)。

2.3免疫共沉淀檢測以IgG為陰性對(duì)照，三組入院第1天的外周血單個(gè)核細(xì)胞中均可檢測到CARD9-Bcl-10復(fù)合體，SAP組灰度值明顯高于MAP組和對(duì)照組(P<0.05)。見表2，圖2。

圖2　抗CARD9和抗Bcl-10的免疫共沉淀分析

組別n陰性對(duì)照陽性對(duì)照CARD9-Bcl-10復(fù)合體對(duì)照組400.00±0.001314.70±152.232692.33±19.98MAP組660.00±0.003334.92±95.281)2352.21±50.53SAP組320.00±0.004460.79±100.491)5535.67±175.901)2)

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與MAP組相比：2)P<0.05

2.4免疫熒光檢測CARD9、Bcl-10主要共定位于外周血單個(gè)核細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，SAP組CARD9、Bcl-10共表達(dá)細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度均明顯高于MAP組和對(duì)照組；MAP組高于對(duì)照組，且第5天熒光強(qiáng)度與第1天相比明顯降低；SAP組第5天熒光強(qiáng)度仍明顯高于MAP組和對(duì)照組。見圖3。

2.5CARD9、Bcl-10表達(dá)與p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析顯示，老年AP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平與CARD9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.781、0.849，P<0.01);p38 MAPK磷酸化水平與CARD9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.717，P<0.01)。

A～C為對(duì)照組CARD9、Bcl-10、融合圖像；D～F為MAP組第1天CARD9、Bcl-10、融合圖像；G～I(xiàn)為MAP組第3天CARD9、Bcl-10、融合圖像；J～L為MAP組第5天CARD9、Bcl-10、融合圖像；M～O為SAP組第1天CARD9、Bcl-10、融合圖像；P～R為SAP組第3d CARD9、Bcl-10、融合圖像；S～U為SAP組第5天CARD9、Bcl-10、融合圖像圖3　三組細(xì)胞免疫熒光檢測(×400)

3　討　論

CARD9參與機(jī)體識(shí)別細(xì)菌、真菌、病毒等病原體，在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用；而NF-κB、p38通路需要CARD9參與〔4〕。在病原菌感染的CARD9缺陷型小鼠體內(nèi)的IL-6、TNF-α水平明顯降低，機(jī)體抗病原菌能力降低，小鼠死亡率提升〔5〕。體內(nèi)抗細(xì)菌、真菌感染時(shí)，Dectin-1可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)依賴CARD9信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活NF-κB通路生成細(xì)胞因子〔6〕。細(xì)菌感染時(shí)，NOD樣受體、TLR4可經(jīng)CARD9依賴途徑激活p38蛋白和MAPK通路。微生物刺激下CARD9-Bcl-10復(fù)合體是生成炎性因子的重要環(huán)節(jié)。

目前研究認(rèn)為，AP早期為非感染性炎癥反應(yīng)，可能分泌誘導(dǎo)PBMC活化的內(nèi)源性物質(zhì)〔7〕。提示CARD9蛋白表達(dá)在AP患者PBMC中可能具有不同的作用機(jī)制。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AP初期CARD9表達(dá)明顯升高，恢復(fù)期逐漸降低〔8〕，但具體作用機(jī)制仍未明確。本次研究顯示，SAP患者CARD9蛋白表達(dá)水平和p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平均明顯高于對(duì)照組，說明CARD9蛋白在AP發(fā)生、發(fā)展中具有重要地位。相關(guān)性分析顯示，p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平與CARD9表達(dá)呈正相關(guān)，可推測CARD9在AP病情發(fā)展中激活NF-κB、MAPK通路來誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生。本次研究顯示，在AP發(fā)病早期，Bcl-10蛋白變化趨于與CARD9相同，免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，AP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CARD9能夠與Bcl-10相結(jié)合，在胞內(nèi)共表達(dá)，說明SAP患者中存在CARD9-Bcl-10復(fù)合體誘導(dǎo)的NF-κB、MAPK信號(hào)通路活化。

綜上，老年SAP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CARD9與NF-κB、MAPK活化水平呈正相關(guān)，能夠與Bcl-10結(jié)合，激活下游NF-κB、MAPK信號(hào)通路，為老年AP干預(yù)治療提供新的靶點(diǎn)。

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〔2015-12-15修回〕

(編輯袁左鳴)

天津市科委基礎(chǔ)項(xiàng)目(No.14JCYBJC25701-1)

許宏敏(1972-)，女，主管技師，主要從事血液學(xué)及凝血研究。

R57

A

1005-9202(2016)17-4258-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.061