吳毓優(yōu)　高炳玉　劉　玉　夏立平　蘇潔之　陳峙霖

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南　?？凇?70102)

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胸苷酸合成酶基因多態(tài)性與培美曲塞治療海南黎族肺腺癌患者效果的相關(guān)性

吳毓優(yōu)高炳玉劉玉夏立平蘇潔之陳峙霖

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南?？?70102)

目的探討胸苷酸合成酶(TS)rs34743033(5'端非編碼區(qū)28 bp重復(fù)序列)及rs34489327(3'非編碼區(qū)的1 494 bp處6 bp核苷酸片段的缺失或插入)與培美曲塞治療海南黎族肺腺癌患者療效與預(yù)后的相關(guān)性。方法手術(shù)后經(jīng)病理診斷確認(rèn)海南晚期肺腺癌患者104例，采用PCR的方法檢測(cè)5'端28 bp重復(fù)序列多態(tài)性；采用焦磷酸測(cè)序的方法檢測(cè)3'端6 bp核苷酸片段的缺失或插入，隨訪記錄患者的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間和總生存期。結(jié)果TS 基因5'端非編碼區(qū)rs34743033多態(tài)性位點(diǎn)3R/3R、2R/3R、2R/2R基因型在肺腺癌患者所占的比例分別為67.3%(70/104)、17.3%(18/104)、15.4%(16/104)。3'端非編碼區(qū)rs34489327多態(tài)性位點(diǎn)+6 bp/+6 bp、+6 bp/-6 bp、-6 bp/-6 bp基因型在肺腺癌患者中所占比例分別為53.8%(56/104)、34.6%(36/104)、11.5%(12/104)。2R/2R和2R/3R基因型患者分別為12.00和18.50個(gè)月，3R/3R基因型患者中位無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間和總生存時(shí)間分別為11.63和18.17個(gè)月，二者之間無(wú)顯著相關(guān)；-6 bp/-6 bp 和-6 bp/+6 bp基因型患者分別為12.00和18.70個(gè)月，+6 bp/+6 bp基因型患者中位無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間和總生存時(shí)間分別為11.50和19.17個(gè)月，二者之間無(wú)顯著相關(guān)。結(jié)論TS基因rs34743033及rs34489327多態(tài)性可能與培美曲賽治療海南黎族肺腺癌的療效和預(yù)后無(wú)關(guān)。

肺腺癌；胸苷酸合成酶；培美曲塞；基因多態(tài)性

胸苷酸合成酶(TS)是催化dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP關(guān)鍵酶，通過(guò)限制dTTP的合成而影響DNA生物合成的速度〔1～3〕。該酶的活性是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素，因而對(duì)化療過(guò)程的敏感性及治療效果可能存在影響〔4，5〕。酶的活性受到結(jié)構(gòu)及表達(dá)量的影響，而基因多態(tài)性尤其是位于表達(dá)調(diào)控部位的多態(tài)性位點(diǎn)是形成個(gè)體酶活性差異的重要影響因素。rs34743033是位于TS基因5'轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，可以與諸多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合從而影響啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率〔6〕。rs34489327是位于TS基因3'末端的插入缺失多態(tài)性位點(diǎn)，可影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的翻譯效率。以上兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌、腸癌及食管癌藥物臨床療效及預(yù)后存在相關(guān)性，可作為臨床個(gè)體化治療的參考指標(biāo)之一。培美曲塞在海南肺腺癌的臨床治療中屬于常規(guī)治療藥物〔7〕。本研究擬探討海南黎族肺腺癌患者TS基因多態(tài)性與培美曲塞治療肺腺癌療效和預(yù)后的相關(guān)性。

1　材料和方法

1.1一般資料選擇2011年1月至2013年8月在我院手術(shù)治療的晚期肺腺癌患者104例(男84例，女20例)，年齡44～80〔平均(56.9+18.97)歲〕，均經(jīng)病理學(xué)檢查診斷確診為肺腺癌?；颊呋熐把Ｒ?guī)、肝腎功能均正常，心電圖無(wú)明顯異常?；煼桨福鹤⑸溆门嗝狼c500 mg/m2，靜滴；同時(shí)口服地塞米松、葉酸和肌注維生素B12，每21 d為一個(gè)治療周期，共進(jìn)行4個(gè)周期。觀察療效及安全性，隨訪時(shí)間至2016年3月30日，每例患者的隨訪時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)40個(gè)月。

1.2方法①DNA提取。QIAamp?DNA Blood Kit提取全血DNA，采用NanoDrop2000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo SCIENTIFIC)進(jìn)行質(zhì)量控制。② rs34743033多態(tài)性檢測(cè)。采用PCR擴(kuò)增檢測(cè)TS基因5'端轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游附近存在的28個(gè)堿基對(duì)(bp)的串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性。上游引物：5'AGCAGGAAGAGGCGGAGCG3'，下游引物：5'AGCTCCCCGTGCGGCGGAC3'，2R/2R基因型擴(kuò)增片段為222 bp，3R/3R基因型為250 bp，2R/3R基因型出現(xiàn)222 bp和250 bp的兩個(gè)條帶。反應(yīng)體系：2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix，10 μl，上、下游引物各0.2 μl，模板DNA 2 μl，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至20 μl。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性15 min；95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，60 s，40個(gè)循環(huán)。③rs34489327多態(tài)性檢測(cè)。采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)3'端UTR多態(tài)性。上游引物5'AGCAGGAAGAGGCGGAGCG3'，下游引物：5'AGCTCCCCGTGCGGCGGAC3'(5'端生物素標(biāo)記)，測(cè)序引物：5' TGATGTAGAGTGTGGTTATGAAC3'。④療效評(píng)價(jià)指標(biāo)：記錄無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)和總生存期(OS)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素分析。

2　結(jié)　果

2.1rs34743033多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果TS基因5'端非編碼區(qū)重復(fù)序列在肺腺癌患者中，3R/3R、2R/3R、2R/2R基因型所占的比例分別為67.3%(70/104)、17.3%(18/104)和15.4%(16/104)。

2.2TS基因rs34489327多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果三種基因型+6 bp/+6 bp、+6 bp/-6 bp、-6 bp/-6 bp在肺腺癌患者中所占比例分別為53.8%(56/104)、34.6%(36/104)、11.5%(12/104)。

2.3TS 基因多態(tài)性與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性104例肺腺癌患者中，2R/2R+2R/3R基因型患者中位PFS和OS分別為12.00和18.50個(gè)月，3R/3R基因型患者中位PFS和OS分別為11.63和18.17個(gè)月，二者之間無(wú)顯著相關(guān)性。提示患者TS 基因5'端非編碼區(qū)重復(fù)序列多態(tài)性與肺腺癌預(yù)后缺少相關(guān)性。-6 bp/-6 bp及-6 bp/+6 bp基因型患者中位PFS和OS分別為12.00 和18.70個(gè)月，+6 bp/+6 bp基因型患者則分別為11.5和19.27個(gè)月，組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

圖1　海南肺腺癌患者不同基因型與PFS、OS的相關(guān)性

3　討　論

TS的表達(dá)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)〔5〕。rs34743033與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合有可能刺激和增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，從而影響基因表達(dá)效率。Shintani等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，3R/3R基因型肺癌組織蛋白水平較2R/2R，2R/3R高，而且基因型與mRNA表達(dá)水平存在相關(guān)性。rs34489327是也可能通過(guò)影響TS mRNA的穩(wěn)定性從而影響TS基因的表達(dá)。Mandola等〔9〕通過(guò)體外熒光標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)-6 bp等位基因在體外降低TS mRNA的穩(wěn)定性，在體內(nèi)降低TS的表達(dá)。

培美曲塞在非鱗非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的亞組分析中體現(xiàn)了治療優(yōu)勢(shì)〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)腺癌與非腺癌組織中TS基因表達(dá)存在顯著差異〔11〕?；颊邆€(gè)體和種族的差異往往會(huì)影響個(gè)體

對(duì)腫瘤的易感性以及對(duì)化療藥物的敏感性甚至預(yù)后。本研究選擇海南黎族肺腺癌患者作為研究對(duì)象，初步的研究結(jié)果表明，以上兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)可能與培美曲賽治療海南黎族肺腺癌的療效和預(yù)后無(wú)關(guān)。在現(xiàn)今倡導(dǎo)個(gè)體化醫(yī)療的時(shí)代，需要綜合考慮組織類型、基因突變和更多的生物標(biāo)志物的表達(dá)情況作為患者臨床用藥和預(yù)后的評(píng)估因素。本研究檢測(cè)的TS多態(tài)性只是TS基因多態(tài)性中的兩種，要得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，需要結(jié)合考慮更多的因素、進(jìn)行更多大樣本的前瞻性研究。

1張婷婷,崔蓮花,于壯,等.胸苷酸合成酶基因多態(tài)性與肺癌易感性關(guān)系〔J〕.中國(guó)公共衛(wèi)生,2011；27(11):1378-80.

2Balboa-Beltrán E,Cruz R,Carracedo A,etal.Delimiting allelic imbalance of TYMS by allele-specific analysis〔J〕.Medicine,2015;94(27):e1091.

3Goff LW,Thakkar N,Du L,etal.Thymidylate synthase genotype-directed chemotherapy for patients with gastric and gastroesophageal junction cancers〔J〕.PLoS ONE,2014;9(9):e107424.

4Avallone A,Gennaro ED,Silvestro L,etal.Targeting thymidylate synthase in colorectal cancer:critical re-evaluation and emerging therapeutic role of raltitrexed〔J〕.Expert Opin Drug Saf,2014;13(1):113-29.

5Jagielska EB,Ucienniczak AP,Browska MD,etal.Trichinella pseudospiralis vs.T. spiralis thymidylate synthase gene structure and T.pseudospiralis thymidylate synthase retrogene sequence〔J〕.Parasit Vectors,2014;7(1):64-8.

6Dunna NR,Naushad SM,Vuree S,etal.Association of thymidylate synthase 5'-UTR 28bp tandem repeat and serine hydroxymethyl transfarase C1420T polymorphisms with susceptibility to acute leukemia〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2014;15(4):1719-23.

7于飛,劉曉晴,李曉燕,等.培美曲塞單藥或聯(lián)合鉑類三線及以上治療晚期非鱗型非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察〔J〕.中國(guó)肺癌雜志,2012;15(2):117-21.

8Shintani Y，Ohta M，Hirabaynshi H，etal.New prognostic indicator for non-small-cell lung cancer，quantitation of thymidylate synthase by real-time reverse transcription polymemse chain reaction〔J〕.Int J Cancer，2003;104(6)：790-5.

9Mandola MV,Stochlmaeher J,Zhang W，etal.A 6 bp polymorphism in the thymidylate synthase gene causes message instability and is associat-ed with decreased intratumoral TS mRNA levels〔J〕.Pharmacogenetics，2004;14(3)：319-27.

10Assinri D,Scarpi E,Saqrtori S,etal.Second-line treatments in non-small cell lung cancer：a systematic reviews of literature and metaanalysis of randomized clinical trials〔J〕.Chest， 2009;135(6):1596-609.

11Tanaka F，Wada H，F(xiàn)ukui Y，etal.Thymidylate synthase(TS)gene expression in primary lung cancer patients：a large-scale study in Japanese population〔J〕.Ann Oncol，2011;22(8)：1791-7.

〔2016-02-10修回〕

(編輯徐杰)

高炳玉(1976-)，男，主任醫(yī)師，主要從事乳腺疾病的研究。

吳毓優(yōu)(1976-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事心胸外科疾病研究。

R73

A

1005-9202(2016)17-4244-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.053