吳曉燕　湯旭磊　傅松波　呂海宏　劉麗娟

(蘭州大學第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅　蘭州　730000)

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人工蟲草對2型糖尿病早期腎病輔助T細胞1/2平衡的影響

吳曉燕湯旭磊傅松波呂海宏劉麗娟

(蘭州大學第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅蘭州730000)

目的探討人工冬蟲夏草(簡稱蟲草)對早期2型糖尿病腎病(T2DN)患者輔助T細胞(Th)1/2細胞的影響。方法選擇60例T2DN患者，隨機分為兩組，蟲草治療組30例，在原用藥物基礎(chǔ)上加用人工蟲草(金水寶膠囊)3粒，每天3次，口服，連用12 w。常規(guī)治療組30例，原用藥繼續(xù)，不加用蟲草。健康對照組20例。檢測T2DN患者治療前后及健康受檢者外周血Th、24 h尿微量白蛋白排泄率(UAER)及高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)的表達。結(jié)果T2DN組外周血CD4+IFN-γ T1細胞，Th1/Th2比值，hs-CRP，UAER均高于健康對照組(P<0.05)；T2DN組CD4+IL-4 Th2細胞低于健康對照組(P>0.05)；蟲草治療組治療后外周血CD4+IFN-γ T細胞，Th1/Th2比值，hs-CRP，UAER較常規(guī)治療組下降更明顯(P<0.05)，CD4+IL-4 Th2細胞數(shù)較常規(guī)治療組升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論蟲草通過調(diào)節(jié)T2DN患者外周血Th1/Th2 淋巴細胞的失衡，減輕其免疫炎癥反應(yīng)，從而減輕尿白蛋白的排出，有利于早期腎功能的恢復。

2型糖尿病；糖尿病腎病；冬蟲夏草;T輔助細胞

早期糖尿病腎病(DN)如能及時治療，腎小球結(jié)構(gòu)及功能可恢復正常，而發(fā)展至臨床DN期，則腎損害為不可逆性。近年來的研究表明2型糖尿病腎病(T2DN)存在著明顯的免疫異?！?〕。研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草具有明顯的免疫調(diào)節(jié)及減輕蛋白尿的作用〔2〕，本研究通過測定蟲草治療前后T2DN患者外周血中的輔助T細胞(Th)1 、Th2，高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及尿24 h尿微量白蛋白排泄率(UAER)的變化，探討蟲草對T2DN患者的Th1/Th2平衡的免疫調(diào)節(jié)作用。

1　資料與方法

1.1一般資料健康對照組：20例，男12例，女8例，健康體檢者，平均年齡(50.5±6.0)歲，漢族，無糖尿病及其他自身免疫性疾病。T2DN組：60例，根據(jù)1999年WHO糖尿病診斷標準和Mogensen DN分期標準，確診早期DN(UAER 20～200 μg/min)60例，男32例，女28例，年齡(50.9±8.7)歲，病程(10.3±3.5)年。系本院內(nèi)分泌科住院患者，T2DN患者隨機分為兩組，蟲草治療組30例，在原用藥物基礎(chǔ)上加用人工蟲草金水寶膠囊(江西濟民可信藥業(yè)有限公司，批號120502)3粒/次，3次/d，口服，連用12 w。常規(guī)治療組30例，原用藥繼續(xù)，不加用蟲草。入組患者均無糖尿病急慢性并發(fā)癥,也無自身免疫性疾病，感染，腫瘤，心力衰竭、高血壓，肝臟損害、泌尿系統(tǒng)感染、腎結(jié)石及其他腎臟疾?。唤谖词褂媚I毒性藥物。所有病例不存在其他因素引起的蛋白尿。

1.2試劑與儀器PERCP標記的抗CD4單抗，PE標記的抗IL-4單抗，PITC標記的抗IFN-γ單抗(均為鼠抗人)。FITC和 PE，PERCP標記的鼠IgG1同型對照免疫球蛋白，佛波醇乙酯(PMA)，離子霉素(ionomycin)，布雷菲德菌素A(BFA)和Fix&Perm破膜劑均購自美國Caltag公司。hs-CRP試劑盒：晶美生物工程有限公司。流式細胞儀為美國Coulter公司EPICS-XL型。

1.3方法

1.3.1試驗設(shè)計對符合條件的60例患者，全部病例均給予低鹽、低蛋白糖尿病飲食，繼續(xù)應(yīng)用原降糖藥物將空腹血糖(FBG)控制在5.6～7.0 mmol/L，餐后2 h血糖<10 mmol/L為滿意。檢測患者入組時及治療12 w后及健康受檢者外周血Th淋巴細胞亞群、血清hs-CRP水平和24 h尿微量白蛋白(UMA)定量，血清尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)，并記錄體重變化。

1.3.2Th1/Th2流式細胞術(shù)檢測 肝素抗凝血5 ml,淋巴細胞分離液分離單核細胞，將細胞數(shù)調(diào)整至1×106/ml，將細胞懸液加入24孔細胞培養(yǎng)板中，加入刺激劑PMA(20 ng/ml)，離子霉素(1 μg /ml)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑BFA(2 μg /ml)以阻止細胞因子向細胞外分泌。37℃,5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)5 h，對細胞表面抗原進行染色，加入破膜劑進行固定-破膜打孔以利于細胞因子單抗進入細胞，進行細胞內(nèi)細胞因子染色，每管加入10 μl INF-γ單抗和IL-4單抗，以相應(yīng)的同種型對照IgG單抗作對照染色，應(yīng)用流式細胞儀對分泌INF-γ的CD4+Th1和分泌IL-4的CD4+Th2進行檢測。

1.3.3血清hs-CRP、UAER的測定取晨起空腹靜脈血2 ml,用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定。正常參考值為254～16 104 ng/ml。UAER免疫分析法，德國Bayer公司DC2000型檢測儀及檢測試劑盒。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS8.0軟件進行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

所有T2DN患者Th1百分比，Th1/Th2比值，血清hs-CRP濃度,24 h UAER均顯著高于健康對照組(P<0.05),Th2與健康對照組無顯著差異(P>0.05)。蟲草治療后與治療前相比Th1百分比，Th1/Th2比值，血清hs-CRP濃度，24 h UAER顯著下降(P<0.05)。而常規(guī)治療組治療后Th1百分比，Th1/Th2比值，血清hs-CRP濃度，24 hUAER較治療前有所下降，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，蟲草治療組及常規(guī)治療組Th2百分比治療前后均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。兩組患者血肌酐及尿素氮治療前后無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1　各組臨床及實驗室資料比較±s)

與健康對照組比較：1)P<0.05；與本組治療前比較：2)P<0.05

3　討　論

DN的發(fā)病機制尚未完全清楚。近來研究發(fā)現(xiàn)免疫因素可能是其發(fā)生的一個重要原因〔3,4〕。研究發(fā)現(xiàn)早期DN存在 Th1/Th2的失衡〔5〕。因此研究DN Th1與Th2的平衡的意義及調(diào)整Th1/Th2平衡有助于更深入的探索DN治療的新途徑。

CD4+Th是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的一種主要細胞，Th1主要負責細胞免疫及炎癥反應(yīng)，Th2與體液免疫有關(guān)〔6〕。生理條件下，機體的Th1和Th2處于相對平衡狀態(tài)，在疾病狀態(tài)下，這種平衡被打破，Th1，Th2所致不同優(yōu)勢免疫應(yīng)答與疾病的發(fā)生、發(fā)展、預后有關(guān)〔7〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種腎臟疾病存在Th1、Th2的失衡。在慢性腎功能不全的患者Th1處劣勢，Th1/Th2比值下降〔8〕。但也有相反的報道，新月體腎炎、類風濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)性腎炎、由Th1應(yīng)答介導〔9〕。Th1/Th2與DN的關(guān)系日益受到關(guān)注，但目前報道比較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，早期T2DN患者的Th1、Th1/Th2比值和hs-CRP均高于健康對照組。相似的報道也見于其他腎臟疾病，有研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅳ型狼瘡性腎炎患者中Th1/Th2比值是升高的，主要以Th1升高為主，這與Ⅳ型狼瘡性腎炎是以免疫復合物沉積介導的免疫反應(yīng)是相一致的〔10〕，也與邱明才等〔11〕通過對DN患者腎活檢發(fā)現(xiàn),沿腎小球、腎小管、腎間質(zhì)和毛細血管有免疫復合物的沉積相一致,根據(jù)以上結(jié)果推測早期T2DN患者存在Th1/Th2的失衡，機體免疫系統(tǒng)的激活產(chǎn)生的炎癥因子可導致血管內(nèi)皮的損傷，進而促進血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。免疫炎癥可能介導了早期DN的發(fā)生。研究表明，人工蟲草(金水寶)治療DN蛋白尿的有效率是對照組有效率的3.34倍〔12〕，是一種很有前景的治療DN的藥物。金水寶膠囊是采用生物工程方法分離的冬蟲夏草菌種經(jīng)低溫發(fā)酵精心研制的純中藥制劑，與天然蟲草主要成分一致〔13〕。臨床研究報道，蟲草真菌有較強的免疫抑制作用，能抑制特異性抗體的產(chǎn)生，能抑制網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬作用，具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用〔14〕。本臨床研究發(fā)現(xiàn)，早期T2DN患者給予人工蟲草治療12 w后,治療前后自身對照,發(fā)現(xiàn)Th1細胞百分比，Th1/Th2 比值，血清hs-CRP濃度，24 h UAER較治療前有所下降，而常規(guī)治療組治療后上述指標有所下降，但無統(tǒng)計學意義。

綜上，T2DN患者經(jīng)蟲草治療后，腎臟免疫炎癥減輕可能是通過影響Th亞群的平衡來實現(xiàn)的，具體機制有待進一步研究。而金水寶膠囊作為DN的一種有效輔助治療藥物，對于改善DN的預后具有重要意義。

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〔2015-01-16修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

湯旭磊(1958-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事內(nèi)分泌代謝病的研究。

吳曉燕(1969-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事2型糖尿病發(fā)病機制的研究。

R392.6

A

1005-9202(2016)17-4216-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.038