薛德冬　張　靜　高麗娜　梁　迪

(山東省勝利油田醫(yī)院藥劑科，山東　東營　257055)

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人乳頭瘤病毒16亞型LAMP檢測(cè)法的建立

薛德冬張靜1高麗娜2梁迪3

(山東省勝利油田醫(yī)院藥劑科，山東東營257055)

目的本研究旨在建立一種簡單、快速、靈敏的檢測(cè)方法，使環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)應(yīng)用于HPV16亞型的檢測(cè)。方法根據(jù)GenBank登錄的HPV16亞型序列(FJ610152)中E7基因序列設(shè)計(jì)了多套特異引物，通過LAMP real-time Turbidimeter儀對(duì)HPV16亞型的LAMP引物進(jìn)行篩選并對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)和實(shí)時(shí)監(jiān)控以檢測(cè)其特異性和敏感性。反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I染料肉眼判定并與儀器檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果建立的LAMP方法在61℃下可對(duì)HPV16核酸進(jìn)行高效擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后加入染料肉眼判定結(jié)果與Real-time Turbidimeter儀檢測(cè)結(jié)果一致；該方法具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性(最低檢出限量為3.0×103 copies/μL)。LAMP法與HPV分型試劑盒對(duì)35份樣品的檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論本研究建立的可視化LAMP方法操作簡便，適用于HPV16的快速檢測(cè)。

人乳頭瘤病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

人乳頭瘤病毒(HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的一種小型雙鏈環(huán)狀DNA 病毒。HPV 感染能引起宮頸癌、生殖器疣等多種性傳播疾病，每年因感染HPV致癌死亡人數(shù)居高不下，HPV已成為潛在的隱形殺手，嚴(yán)重危害人類健康〔1，2〕。HPV主要分為高危型和低危型，報(bào)道高危型HPV16相關(guān)宮頸癌早期診斷率低，宮頸癌癌前病變進(jìn)程更快，HPV16也是宮頸癌再發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔3〕，感染HPV16或HPV18的女性，其病程發(fā)展至宮頸癌前病變的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于未感染者〔4〕。另據(jù)研究表明，宮頸癌患者中70%由高危型HPV16和18感染引起，因此對(duì)HPV高危型的及時(shí)檢測(cè)對(duì)于在宮頸癌未發(fā)生前做出積極治療具有現(xiàn)實(shí)意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)為Notomi于2000年發(fā)明的新型檢測(cè)技術(shù)〔5〕，其原理是針對(duì)六個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)了4條引物對(duì)核酸進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到病毒、細(xì)菌、寄生蟲等領(lǐng)域。SYBR Green I是一種雙鏈DNA染料，當(dāng)結(jié)合了DNA雙鏈時(shí)即可發(fā)出熒光，利用此特性建立可視化的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)使結(jié)果更加一目了然。本試驗(yàn)針對(duì)HPV 16 E7基因設(shè)計(jì)了4條特異性引物(F3、B3、FIP、BIP)，恒溫下對(duì)HPV16進(jìn)行擴(kuò)增，通過LA-320型LAMP Real-time Turbidimeter儀對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，旨在為基層醫(yī)院預(yù)防宮頸癌做出貢獻(xiàn)。

1　材料與方法

1.1材料DNA LAMP Kit、LA-320型LAMP Real-time Turbidimeter儀購自日本榮源株式會(huì)社；Multiskan spectrum紫外分光光度計(jì)；SYBR Green I購自Invitrogen公司；12份已知的單重感染12不同HPV亞型的宮頸刮片樣本及35份未知的宮頸刮片臨床樣本來自長春市人民醫(yī)院，患者年齡為25～47歲。樣本均為專用宮頸刷收集的宮頸分泌物，12份單重感染HPV亞型的臨床樣品由廣東凱普HPV分型試劑盒確認(rèn)。

1.2LAMP引物設(shè)計(jì)采用Primer Explorer V4軟件，根據(jù)GenBank登錄的HPV16亞型序列(FJ610152)中E7基因設(shè)計(jì)多套特異引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。經(jīng)初步篩選后得到一套效果最佳引物，見表1。

表1　HPV16亞型LAMP檢測(cè)引物序列

1.3HPV基因片段合成和純化及定量以Qiagen DNA提取試劑盒提取HPV6亞型宮頸刮片樣本DNA為模板，以HPV LAMP引物的外引物F3和B3為PCR的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；末次循環(huán)72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中后置于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12～16 h，藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒pMD18-T-HPV16，挑取白斑進(jìn)行菌落PCR，采用Omega Biotek質(zhì)粒小量提取試劑盒I型提取重組質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。

1.4LAMP檢測(cè)HPV特異性按Qiagen DNA提取試劑盒說明書分別提取單重感染的12種不同HPV亞型(HPV6、11、42、43、16、18、26、31、51、52、53、56)的宮頸刮片樣本DNA為模板，建立如下體系：5 μl DNA樣本、12.5 μl 2×反應(yīng)緩沖液(RM)、2 μl FIP (10 pmol/μl)、2 μl BIP (10 pmol/μl)、0.5 μl F3 (10 pmol/μl)、0.5 μl B3(10 pmol/μl)、1 μl Bst DNA聚合酶 (EM)、去離子水(DW)補(bǔ)充至25 μl?；靹蚝笾糜贚A-320型LAMP Real-time Turbidimeter儀內(nèi)61℃恒溫?cái)U(kuò)增。見圖1，圖2。記錄擴(kuò)增曲線圖，待反應(yīng)結(jié)束后添加SYBR Green I 5 μl，肉眼觀察陽性管內(nèi)液體顏色熒光情況，檢測(cè)LAMP方法的特異性。

1.5LAMP檢測(cè)HPV靈敏度將1.3提取的質(zhì)粒經(jīng)紫外分管光度計(jì)測(cè)定的濃度記錄，換算為拷貝數(shù)并依次10倍倍比稀釋，依次為3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100copies/μl，LAMP檢測(cè)體系同上。

1.6LAMP與HPV分型試劑盒檢測(cè)宮頸刮片標(biāo)本按Qiagen試劑盒說明書提取35份未知宮頸刮片樣本DNA，分別進(jìn)行LAMP和HPV分型試劑盒檢測(cè)，比較二者結(jié)果。

2　結(jié)　果

2.1LAMP檢測(cè)HPV16亞型特異性對(duì)12份已知的單重感染12種不同亞型(其中HPV6、11、42、43為低危型，HPV16、18、26、31、51、52、53、56為高危型)的樣品DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，見圖1，圖2。結(jié)果顯示：當(dāng)溫度到達(dá)61℃時(shí)，35 min后僅HPV16亞型為陽性，其他試驗(yàn)樣品均為陰性。圖3為反應(yīng)結(jié)束后加入5 μl SYBR Green Ⅰ后管內(nèi)顏色情況，橙黃色為陽性，鐵銹色為陰性，可視化結(jié)果與圖1、圖2結(jié)果一致。

1: HPV6；2：HPV11；3：HPV42；4：HPV43；5：HPV16；6：HPV18；7：HPV26；8：HPV31圖1　HPV6亞型LAMP特異性試驗(yàn)Real-time Turbidimeter分析圖

1: HPV51；2：HPV52；3：HPV53；4：HPV56；5：陰性對(duì)照?qǐng)D2　HPV16亞型LAMP特異性試驗(yàn)Real-time Turbidimeter分析圖

1～13：HPV6、HPV11、 HPV42、 HPV43、 HPV16、 HPV18、 HPV26、 HPV31、 HPV51、 HPV52、 HPV53、 HPV56、陰性對(duì)照?qǐng)D3　HPV16亞型LAMP特異性試驗(yàn)可視化圖

2.2LAMP檢測(cè)HPV6型靈敏度結(jié)果顯示，建立的LAMP體系檢測(cè)方法最低檢測(cè)濃度為3×103copies/μl，待反應(yīng)結(jié)束后加入5 μl SYBR Green I后管內(nèi)顏色情況(圖4)與Real-time Turbidimeter儀檢測(cè)結(jié)果一致(圖5)，表明該方法有較高敏感性。

1～8：2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100 copies/μl圖4　HPV16亞型LAMP敏感性試驗(yàn)可視化圖

CH1～8：3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100 copies/μl圖5　HPV16亞型LAMP敏感性試驗(yàn)real-time Turbidimeter分析圖

2.3LAMP與凱普HPV分型試劑盒檢測(cè)宮頸刮片標(biāo)本的結(jié)果對(duì)比對(duì)長春市中心醫(yī)院提供的35份宮頸刮片臨床標(biāo)本進(jìn)行LAMP檢測(cè)和凱普分型試劑盒檢測(cè)，LAMP方法共檢測(cè)出10份HPV16亞型感染樣本，25份陰性樣本，凱普HPV分型試劑盒共檢測(cè)出10份HPV16亞型感染樣本，17份陰性和8份其他HPV亞型感染樣本。二者檢測(cè)結(jié)果一致且不存在交叉反應(yīng)，說明本研究建立的HPV16亞型LAMP檢測(cè)方法適用于臨床檢測(cè)。

3　討　論

目前已有100多種HPV亞型被鑒定，其中約40余種與人類生殖器皮膚薪膜病變有關(guān)。根據(jù)其對(duì)生殖系統(tǒng)的致癌性，可將其分為低危型和高危型，前者包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81等，以HPV6最為常見，主要引起尖銳濕疣等良性病變；后者包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、72、82等〔6〕，其中以HPV16、18最為常見，常引起惡性病變，如宮頸癌〔7～9〕。由于HPV的致病性與其亞型密切相關(guān)，所以對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和分型對(duì)于臨床診斷具有重要意義。

本研究基于顏色判定的LAMP技術(shù)對(duì)HPV16亞型E7基因設(shè)計(jì)四條特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶恒溫條件下完成擴(kuò)增，比其他檢測(cè)方法節(jié)省時(shí)間且敏感性高。反應(yīng)中對(duì)HPV16亞型進(jìn)行了檢測(cè)，通過對(duì)其他12種不同亞型的臨床樣

本進(jìn)行特異性分析，61℃恒溫?cái)U(kuò)增后僅HPV16為陽性，其他均為陰性，待反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I〔10〕后可視化結(jié)果與LAMP real-time Turbidimeter LA-320儀結(jié)果一致，敏感性試驗(yàn)表明本研究建立的LAMP檢測(cè)方法最低檢出限量為3.0×103copies/μl，具有較強(qiáng)的敏感性，之后對(duì)35份未知的宮頸刮片臨床樣品進(jìn)行了臨床檢測(cè)，證明了本方法特異性強(qiáng)且無交叉反應(yīng)。

宮頸癌的前期病變是一個(gè)相對(duì)較長的時(shí)間過程，在診斷后進(jìn)行干預(yù)治療是預(yù)防宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要手段，因此宮頸癌的診治是防癌變的重要內(nèi)容。本研究著重針對(duì)高危型HPV16建立了可視化的LAMP檢測(cè)方法，利用LAMP real-time Turbidimeter LA-320儀針對(duì)HPV反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控在國內(nèi)尚屬首次，HPV16核酸在61 ℃的恒溫條件下反應(yīng)35 min，即可判定結(jié)果，反應(yīng)結(jié)束后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入了SYBR Green Ⅰ實(shí)現(xiàn)了LAMP的可視化，結(jié)果更為直觀，本方法具有操作簡便、敏感性高、成本低廉的特點(diǎn)，為基層醫(yī)院檢測(cè)帶來方便，為HPV的快速檢測(cè)提供了一種新的途徑。

1崔麗陽，岳天孚.高危型HPV持續(xù)感染的影響因素探討〔J〕.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014;20(3)：209-12.

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4堯榮鳳，趙旭鴻，李智.不同年齡段女性人乳頭瘤病毒感染狀況分析〔J〕.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014;29(7):708-11.

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〔2015-12-18修回〕

(編輯袁左鳴)

梁迪(1979-)，男，博士，講師，主要從事生物化學(xué)研究。

薛德冬(1978-)，男，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)、醫(yī)院藥學(xué)方面研究。

R3

A

1005-9202(2016)17-4180-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.020

1吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥品管理部

2吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科3吉林大學(xué)藥學(xué)院