紀海茹　孔令偉　孔　維　趙淑敏　孔祥玉　陳　萌　鄭小影

(承德醫(yī)學院，河北　承德　067000)

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丁苯酞預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1和血腦屏障的影響

紀海茹孔令偉孔維1趙淑敏1孔祥玉1陳萌1鄭小影1

(承德醫(yī)學院，河北承德067000)

目的探討丁苯酞(NBP)預處理對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1和血腦屏障的影響。方法90只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、NBP預處理組低劑量組(NBPⅠ組)、NBP預處理組中劑量組(NBPⅡ組)、NBP預處理組高劑量組(NBP Ⅲ組)，每組18只。采用線栓法制作大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，缺血2 h再灌注24 h后以干濕重法測定腦組織含水量，收集腦血管外伊文思藍(EB)含量來評估血腦屏障的破壞程度，qPCR法檢測MMP-9及TIMP-1 mRNA的表達水平。結果腦缺血再灌注后，腦組織含水量及EB含量明顯增加，MMP-9和TIMP-1表達均增強，與假手術組比較有顯著差異(P<0.01)。NBP預處理各組腦組織含水量及EB含量較模型組明顯下降，MMP-9表達顯著減少，TIMP-1表達明顯增加(P<0.01)，NBPⅡ、Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)。結論NBP預處理對CIRI大鼠可通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的表達，降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫，發(fā)揮預防性保護作用。

丁苯酞;預處理;腦缺血再灌注損傷;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

腦缺血再灌注損傷(CIRI)后產(chǎn)生大量自由基、炎癥因子等有害物質(zhì)，使血腦屏障(BBB)通透性增加，水和血漿成分漏出到周圍腦組織，最終導致血管源性腦水腫，嚴重時甚至可發(fā)生腦疝。顱內(nèi)壓增高又進一步加劇BBB的破壞和腦血管通透性增加，導致腦水腫，形成惡性循環(huán)〔1〕。因此，通過保護BBB來減輕腦水腫的程度被看作治療CIRI的關鍵環(huán)節(jié)。近年研究顯示〔2〕，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9可降解細胞外基質(zhì)、改變血管通透性，導致BBB破壞和腦水腫的發(fā)生，其在CIRI后表達顯著增加?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1是MMP-9的特異性抑制劑，二者平衡關系的失調(diào)參與了BBB的破壞。觀察CIRI后二者表達水平的變化對評價藥物治療價值有重要意義〔3〕。丁苯酞(NBP)軟膠囊是作用于缺血性腦卒中多個靶點、多個環(huán)節(jié)的創(chuàng)新藥物〔4〕，對缺血性腦卒中有肯定的治療作用，但其預防性保護作用的機制尚不明了，本研究探討NBP對CIRI預防性保護作用及機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，SPF級，體重260～280 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司〔許可證號：SCXK(京)2012-0001〕。大鼠經(jīng)適應性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為假手術組、模型組、NBP預處理組低劑量組(NBPⅠ組)、NBP預處理組中劑量組(NBPⅡ組)、NBP預處理組高劑量組(NBP Ⅲ組)，每組18只。

1.2實驗藥品及試劑NBP軟膠囊由石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供，批號：118120711；伊文思藍購自TCI公司，批號：W8IFA-AT；RNasio Plus購自寶生物工程有限公司，批號：AK3701；實時熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司，批號：AK8203、AK2102。

1.3實驗儀器實時熒光定量PCR儀Mx3000P，美國安捷倫 Stratagene公司;3K30型冷凍離心機，德國SIGMA公司;移液器;勻漿器;顯微手術器械;直徑0.23 mm的魚線;自制大鼠固定板。

1.4實驗方法

1.4.1動物模型制備及處理大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后，灌胃給藥，NBPⅠ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別給予NBP 20、40、80 mg·kg-1·d-1，假手術組和模型組給等容積的生理鹽水，共7 d。模型組及給藥組采用Longa等〔5〕改良線栓法制備大鼠(MCAO)模型，假手術組僅分離右側頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，不插入線栓。術后單籠飼養(yǎng)，電暖氣低檔保暖。缺血2 h后抽提栓線至頸外動脈殘端內(nèi)進行再灌注，再灌注24 h后做相應處理。

1.4.2腦組織含水量測定采用干濕重法。每組取6只大鼠麻醉后迅速取腦，去除小腦和腦干，分離出右側大腦，用電子天平稱其濕重后，置于100℃烤箱中烤干至恒重，腦組織含水量計算公式：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.3BBB通透性測定采用伊文思藍(EB)作為示蹤劑監(jiān)測BBB損傷程度的方法。各組取6只大鼠，再灌注23 h后，經(jīng)大鼠尾靜脈注入2%的EB(4 ml/kg)，大鼠球結膜、皮膚等部分變藍表示注入成功。循環(huán)1 h后，經(jīng)心臟灌注預冷的生理鹽水至右心房流出清亮液體時，快速斷頭取腦，取缺血側腦組織稱濕重后放入5 ml甲酰胺溶液中浸泡，54℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，1 000 r/min離心5 min，移液器吸取其上清液200 μl用酶標儀測定其630 nm處的OD值。甲酰胺溶液做空白比色。腦組織EB含量計算公式：腦組織EB含量(μg/g)=待測樣品EB含量(μg/ml)×甲酰胺容量(ml)/腦濕重(g)，待測樣品EB含量根據(jù)標準曲線求得。

1.4.4實時熒光定量PCR方法檢測MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平每組取6只大鼠，再灌注24 h后麻醉取腦，預冷的生理鹽水沖洗后取缺血側腦皮質(zhì)置于無酶管中-80℃凍存。使用寶生物工程有限公司提供的RNAsio Plus提取總RNA，紫外分光光度計檢驗RNA純度，要求波長在260/280 nm處吸光度比值為1.8～2.2。根據(jù)GenBank上登陸的MMP-9、TIMP-1的基因序列，以β-actin為內(nèi)參照，設計合成引物。β-actin正義鏈：5′-CGCTGACAAGAAGTGGGGTTT-3′,反義鏈：5′-TACAGATGGTGGATGCCTTTTATG-3′；MMP-9正義鏈：5′-CCTGGTTCCCTGGCATAATC-3′；反義鏈：5′-CGCTCTGGTAGCCCTTCTC-3′；TIMP-1正義鏈：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′；反義鏈：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。根據(jù)Takara公司提供的實時熒光定量試劑盒采用SYBR法對MMP-9、TIMP-1 mRNA的表達水平進行測定，總反應體系為25 μl，包括Premix Ex TaqⅡ 12.5 μl,cDNA 2 μl，滅菌蒸餾水8.5 μl，上下游引物各1 μl(10 μmol/L)，放入實時定量PCR反應儀，反應條件：預變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火51℃(MMP-9)、48℃(TIMP-1) 30 s，延伸72℃ 30 s，反應循環(huán)數(shù)為40，設置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴增和引物二聚體的出現(xiàn)。分析方法利用2-ΔΔCt的方法。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件進行One-way ANOVA檢驗。

2　結　果

2.1NBP預處理對腦組織含水量的影響 與假手術組比較，模型組與NBP預處理各組大鼠腦組織含水量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，NBP預處理各組大鼠腦組織含水量均顯著減少(P<0.01)，NBPⅡ、Ⅲ組較NBPⅠ組減少更明顯(P<0.05)，但NBPⅡ、Ⅲ組之間差異并不明顯(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠大腦缺血側腦含水量、EB含量及MMP-9、TIMP-1 mRNA相對表達量的比較

與假手術組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.01；與NBPⅠ組比較：3)P<0.05

2.2NBP預處理對腦組織BBB通透性的影響 與假手術組比較，模型組與NBP預處理各組大鼠腦組織BBB通透性均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，NBP各組大鼠腦組織BBB通透性均顯著降低(P<0.01),NBPⅡ、Ⅲ組較NBPⅠ組降低更多(P<0.05)，但NBPⅡ、Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.3NBP預處理對腦組織MMP-9和TIMP-1 mRNA表達的影響假手術組大鼠腦組織內(nèi)有MMP-9和TIMP-1均有微量表達；模型組大鼠腦組織內(nèi)MMP-9的表達與假手術組比較明顯升高，TIMP-1也相應升高(P<0.01)；NBP預處理各組MMP-9表達均減少(P<0.01)，TIMP-1表達均增加(P<0.01)，其中NBPⅡ組較NBPⅠ組減少明顯(P<0.05)，NBP Ⅲ組與NBPⅡ組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

3　討　論

近年研究顯示，BBB的完整性在CIRI時發(fā)揮著舉足輕重的作用〔6〕，MMP-9是BBB損傷的關鍵點〔7〕，其在正常組織內(nèi)僅有低水平的表達，在缺血缺氧等情況下表達量大幅增加〔8，9〕，可由星形細胞、 血管內(nèi)皮細胞、 小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等合成并分泌〔10〕，其在細胞外被激活后可水解細胞外基質(zhì)，破壞BBB，致其通透性增加，引起血管源性腦水腫〔11〕。Asahi等〔12〕發(fā)現(xiàn)，敲除MMP-9基因的小鼠腦梗死體積明顯縮小，BBB破壞程度也顯著減輕。TIMP-1是MMP-9的內(nèi)源性組織抑制因子,可與MMP-9特異性結合進而抑制其活性，阻斷MMP-9對細胞外基質(zhì)和基底膜的降解〔13〕，二者的表達變化與腦含水量變化一致，參與了血腦屏障及血管基底膜的破壞〔14〕。本實驗結果顯示，缺血2 h再灌注24 h后，EB含量顯著增加，MMP-9表達明顯增多，與文獻報道一致〔15〕。

NBP可作用于腦缺血病理的多個環(huán)節(jié)，改善缺血后的多種病理變化，具有保護線粒體功能、抑制脂質(zhì)過氧化、清除自由基、抑制炎癥反應、恢復能量代謝、抑制血小板集聚及增加缺血區(qū)血流量等藥理作用〔16〕。邵小鵬等〔17〕應用NBP治療老年血管性癡呆取得較好療效。

NBP預處理可能通過下調(diào)MMP-9、上調(diào)TIMP-1的表達，減輕BBB的損傷，降低腦水腫程度，進而發(fā)揮對CIRI的預防性的保護作用。提示NBP可預防性應用于缺血性腦卒中的高危人群，減輕腦損傷，為臨床防治缺血性腦損傷提供了新的思路。

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2劉昱言,劉軻,劉敬霞,等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2、-9與腦缺血微血管損傷的關系〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(1):257-9.

3田培超,王懷立.MMP-9及TIIMP-1在大鼠感染性腦水腫的表達和意義〔J〕.中國實用神經(jīng)疾病雜志,2007;10(3):9-11.

4紀海茹,孔維,趙淑敏,等.丁苯酞對腦缺血再灌注損傷保護作用的研究進展〔J〕.承德醫(yī)學院學報,2014;31(3):239-41.

5Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

6陳萌,孔維,趙淑敏,等.黃芩莖葉總黃酮預處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元和血腦屏障形態(tài)學的影響〔J〕.解剖學雜志,2012;35(3):341-4.

7曲思鳳,王佳妮,魏欣冰,等.氯沙坦對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性和MMP-9表達的影響〔J〕.山東大學學報,2007;45(10):992-5.

8Wu Y,Wang YP,Guo PP,etal.A Lipoxin A4 analog ameliorates blood-brain barrier dysfunction and reduces MMP-9 expression in a rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion injury〔J〕.J Mol Neurosci,2012;46(3): 483-91.

9Xiang J,Lan R,Tang YP,etal.Apocynum venetum leaf extract attenuates disruption of the blood-brain barrier and upregulation of matrix metalloproteinase-9/-2 in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion injury〔J〕.Neurochem Res,2012;37(8):1820-8.

10Jimei L,Yin L,Molly O,etal.DL-3-n-butylphthalide prevents neuronal cell death after focal cerebral ischemia in mice via the JNK pathway〔J〕.Brain Res,2010;1359:216-26.

11Gong Y,Hart E,Shchurin A,etal.Inflammatory macrophage migration requires MMP- 9 activation by plasminogen in mice〔J〕.J Clin Invest,2008;118(9):3012-24.

12Asahi M,Wang X,Mori T,etal.Effects of matrix metalloproteinase 9 gene knock out on the proteolysis of blood brain barrier and white matter components after cerebral ischemia〔J〕.J Neurol Sci,2001;21(19):7724-32.

13Krizanac-Bengez L,Hossain M,Fazio V,etal.Loss of flow induces leukocyte-mediated MMP/TIMP imbalance in dynamic in vitro blood brain barrier model role of pro-inflammatory cytokines〔J〕Am J Physiol Cell Physiol,2006;291(4):C740-9.

14陳合成,楊金升,楊軍,等.白藜蘆醇對大鼠腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶-9及其組織抑制因子-1表達的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志,2007;9(10):703-6.

15高蘭，婁季宇，楊霄鵬.丁苯酞對腦缺血再灌注損傷大鼠MMP-9活性和血腦屏障通透性的影響〔J〕.中風與神經(jīng)疾病雜志,2012;29(2):116-8.

16李延可,劉寧,陳江君.丁苯酞對急性缺血性腦卒中的作用及機制研究〔J〕.中國醫(yī)藥導刊,2012;14(2):254-5.

17邵小鵬,桂樹華,胡玲玲.丁苯酞治療老年血管性癡呆的臨床療效及對精神心理量表的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(22):5601-2.

〔2014-12-10修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

承德醫(yī)學院2016年校級課題項目(No.201627)

趙淑敏(1954-)，女，碩士，教授，碩士生導師，主要從事超微病理學，心、腦血管缺血性損傷機制與修復研究。

紀海茹(1987-)，女，住院醫(yī)師，在讀碩士，主要從事藥物治療缺血性腦血管疾病研究。

R965

A

1005-9202(2016)17-4171-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.016

1承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學部