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(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧　錦州　121001)

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雪蓮菌發(fā)酵乳對(duì)慢性肝損傷大鼠肝功能的影響

劉馨孔淵?；萆甑栏?/p>

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001)

目的探討雪蓮菌發(fā)酵乳對(duì)四氯化碳(CCl4)導(dǎo)致的慢性肝損傷大鼠肝功能的影響。方法采用CCl4制備大鼠慢性肝損傷模型，設(shè)正常組、模型組、雪蓮菌發(fā)酵乳組和聯(lián)苯雙酯組(陽(yáng)性對(duì)照)。測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量，同時(shí)觀察肝組織病理變化。結(jié)果模型組大鼠有明顯肝損傷表現(xiàn)，各給藥組肝損傷均有不同程度的改善(P<0.01 或P<0.05)。病理組織學(xué)檢查結(jié)果表明，給藥組肝臟病變程度均較模型組明顯減輕。結(jié)論雪蓮菌發(fā)酵乳可以緩解CCl4誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷。

雪蓮菌；慢性肝損傷

雪蓮菌，又稱西藏靈菇、藏靈菇，外形酷似米粒，是一種乳白色、膠質(zhì)狀的塊狀物的野生菌，由微生物產(chǎn)生的胞外多糖與乳蛋白聚合而成〔1,2〕。雪蓮菌是一種天然形成的混菌發(fā)酵系統(tǒng)，是由多種微生物組成的微生態(tài)共生體系，其中包含乳酸菌和酵母菌及少量的醋酸菌〔3，4〕。Maeda等〔5〕發(fā)現(xiàn)雪蓮菌對(duì)自發(fā)性高血壓易卒中型大鼠具有降血脂降血壓的效應(yīng)，Diniz等〔6〕研究認(rèn)為雪蓮菌具有抗炎作用，Vinderola等〔7〕發(fā)現(xiàn)雪蓮菌具有調(diào)節(jié)免疫的功能，Silva等〔8〕發(fā)現(xiàn)雪蓮菌的殺菌作用，Gao等〔9〕又發(fā)現(xiàn)雪蓮菌發(fā)酵乳的cell-free fraction部分具有抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖的效應(yīng)。本研究擬分析雪蓮菌發(fā)酵乳對(duì)四氯化碳(CCl4)導(dǎo)致慢性肝損傷大鼠的肝功能影響。

1　材料與方法

1.1材料雪蓮菌：西藏林芝生態(tài)綠色農(nóng)業(yè)合作社生產(chǎn)；聯(lián)苯雙酯滴丸： 北京協(xié)和藥廠；CCl4：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；魯花牌花生油：山東魯花集團(tuán)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(AIB)測(cè)定試劑盒均為長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；健康 SD 雄性大鼠 40 只，體重(200±20)g，購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：LY20141122。

1.2造模所有動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，在適宜的溫度和濕度下飼養(yǎng)，光照周期 12 h/12 h；適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。按照隨機(jī)分配原則，選取10只大鼠作為正常組，其余的 30 只大鼠進(jìn)行慢性肝損傷造模。根據(jù)文獻(xiàn)記載〔10〕，給予需要造模的大鼠腹腔注射 50% CCl4/花生油溶液 0.15 mg/100 g ，每周注射兩次共注射8 w，建立大鼠慢性肝損傷模型。參照Rizk等〔11〕的方法制備雪蓮菌發(fā)酵乳，雪蓮菌粒培養(yǎng)于滅菌脫脂乳中，接種量5 g/100 ml，置于28℃條件下恒溫培養(yǎng)，每24 h更換一次滅菌脫脂乳，連續(xù)培養(yǎng)3 d。取第3天的發(fā)酵乳，濾去雪蓮菌粒，得到雪蓮菌發(fā)酵乳，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3分組給藥將造模成功后的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、雪蓮菌發(fā)酵乳組和聯(lián)苯雙酯(陽(yáng)性對(duì)照)組，每組10只。正常組和模型組大鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃，雪蓮菌發(fā)酵乳組大鼠給予1 ml/100 g劑量的雪蓮菌發(fā)酵乳灌胃，聯(lián)苯雙酯組灌胃 0.1 g/kg聯(lián)苯雙酯，1次/d，連續(xù)8 w。8 w后應(yīng)用 0.6%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采集下腔靜脈血 3 ml，3 000 r/min離心10 min，留取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定 ALT、AST、ALP、TP、ALB水平。剪取大鼠肝左葉相同部位肝組織，置于 4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制備4 μm切片，HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的損傷情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件，兩組組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。

2　結(jié)　果

2.1動(dòng)物的一般狀態(tài)正常組：大鼠毛有光澤，活動(dòng)自如，飲食及大小便正常；模型組：隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)活動(dòng)逐漸減少， 動(dòng)物普遍出現(xiàn)食欲差，鼠毛稀疏， 皮毛粗糙無(wú)光澤，精神較萎靡，飲食量減少。在整個(gè)造模過(guò)程中體重增加緩慢，特別是在造模后期體重基本不增加甚至減輕；雪蓮菌發(fā)酵乳組：大鼠毛光澤，活動(dòng)、飲食及大、小便均較模型組有所改善，給藥期間動(dòng)物體重有所增加；聯(lián)苯雙酯組：大鼠一般情況改善效果較雪蓮菌發(fā)酵乳組更明顯。

2.2各組大鼠血清中 ALT、AST、ALP 活性情況與正常組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP均明顯升高，雪蓮菌發(fā)酵乳組及聯(lián)苯雙酯組大鼠血清ALT、AST、ALP水平有所降低，其中以聯(lián)苯雙酯組更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血清ALT、AST、ALP活性比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3各組大鼠血清中 TP、ALB水平變化變化與正常組相比，模型組大鼠血清TP和ALB水平均明顯升高，給藥后與模型組大鼠相比，雪蓮菌發(fā)酵乳組及聯(lián)苯雙酯組大鼠血清TP升高；聯(lián)苯雙酯組大鼠的ALB水平較模型組有所回升(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠血清 TP、ALB比較

圖1　各組大鼠肝臟病理改變(HE)

2.4雪蓮菌發(fā)酵乳對(duì)CCl4致慢性肝損傷大鼠肝臟病理?yè)p傷的影響圖1可見(jiàn)，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無(wú)細(xì)胞變性壞死，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也無(wú)膠原沉積模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞變性嚴(yán)重，有明顯的脂肪變，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原增生嚴(yán)重。雪蓮菌發(fā)酵乳組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，肝內(nèi)亞假小葉結(jié)構(gòu)有所減少，細(xì)胞變性較少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，膠原增生較輕。聯(lián)苯雙酯組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，細(xì)胞變性現(xiàn)象較少見(jiàn)。

3　討　論

慢性肝損傷是機(jī)體在應(yīng)對(duì)各種生物或者非生物損傷的過(guò)程中，致病因子刺激過(guò)程中所致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損。若致病因子長(zhǎng)時(shí)間存在，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死，甚至肝組織內(nèi)膠原沉積，導(dǎo)致肝纖維化，最終可以導(dǎo)致肝功能障礙，甚至肝衰竭〔10,12〕。CCl4進(jìn)入大鼠肝臟，激活肝臟細(xì)胞色素 P450，繼而生成 CCl3，其可攻擊肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的磷脂分子，引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞〔13,14〕。隨著中毒次數(shù)與時(shí)間的增加和延長(zhǎng)，慢性肝損傷及其早期肝纖維化就會(huì)越來(lái)越明顯。

CCl4所致大鼠慢性肝損傷的重要指標(biāo)是血清 ALT、AST、ALP 酶活性明顯升高，ALB、TP含量明顯降低和肝臟病理學(xué)的變化。雪蓮菌包含由多種微生物組成的微生態(tài)群落，具有抗炎、殺菌、降血脂、降血壓、增強(qiáng)免疫力、防止癌細(xì)胞擴(kuò)散等作用。Huseini等〔15〕發(fā)現(xiàn)雪蓮菌發(fā)酵乳(國(guó)外稱為開(kāi)菲爾)是一種治療嚴(yán)重?zé)齻挠行幬铮湫Ч蛡鹘y(tǒng)磺胺嘧啶銀鹽治療療效相當(dāng)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雪蓮菌發(fā)酵乳干預(yù)后，肝損傷模型大鼠血清中 ALT、AST、ALP活性均有所降低，ALB、TP 含量有所升高，肝組織病理明顯改善；雖沒(méi)有聯(lián)苯雙酯改善效果明顯，但已表明雪蓮菌發(fā)酵乳對(duì)CCl4所致動(dòng)物慢性肝損傷具有一定的保肝降酶作用。

1周龍霞,鄭學(xué)云,薛鋒,等.天山雪蓮菌酸奶中菌株的分離及生理生化鑒定〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013；41(18):7963.

2Zhou JZ,Liu XL,Huang KH,etal.Application of the mixture design to design the formulation of Pure cultures in Tibetan kefir〔J〕.Agric Sci Chin,2007;6(11):1383-9.

3高潔.雪蓮菌菌相分析及抗癌活性研究〔D〕.杭州：浙江大學(xué),2013.

4Chen ZN,Shi JL,Yang XJ,etal.Chemical and physical characteristics and antioxidant activities of the exopolysaccharide produced by Tibetan kefir grains during milk fermentation 〔J〕.Int Dairy J,2015;43(1):15-21.

5Maeda H,Zhu X,Omura,K,etal.Effects of an exo-polysaccharide (kefir grain)on lipids,blood pressure,blood glucose,and constipation 〔J〕.Biofactors,2004;22(1-4):197-200.

6Diniz RO,Garla LK,Schneedorf JM,etal.Study of anti-inflammatory activity of Tibetan mushroom,a symbiotic culture of bacteria and fungi encapsulated into a polysaccharide matrix〔J〕.Pharmacol Res,2003;47(1):49-52.

7Vinderola CG,Duarte J,Thangavel D,etal.Immunomodulating capacity of kefir 〔J〕.J Dairy Res,2005;72(2):195-202.

8Silva KR,Rodrigues SA,Xavier L,etal.Antimicrobial activity of brothfermented with kefir grains 〔J〕.Appl Biochem Biotechnol,2009;152:316-25.

9Gao J,Gu F,Hui R,etal.Induction of apoptosis of gastric cancer cells SGC7901 in vitro by a cell-free fraction of Tibetan kefir 〔J〕.Int Dairy J,2013;30(1):14-8.

10張海燕,溫韜,盧靜,等.四氯化碳誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷模型方法的探討〔J〕.實(shí)用肝臟病雜志,2009；12(3):161-3.

11Rizk S,Maalouf K,Baydoun E.The antiproliferative effect of kefir cell-free fraction on HuT-102 malignant T lymphocytes 〔J〕.Clin Lymphoma Myeloma,2009;9(Suppl 3):S198-203.

12何云,王宇明.銀杏內(nèi)酯防治四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的作用觀察〔J〕.實(shí)用肝臟病雜志,2009；12(1):8-10.

13馬駿,徐穎,黃正明,等.苯丙氨酸二肽類化合物190對(duì)小鼠CCl4肝損傷的保護(hù)作用〔J〕.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2009；25(5):383-6.

14程麗娟,陳曉農(nóng),劉青川,等.靈五顆粒對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷的影響〔J〕.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011；30(7):865-9.

15Huseini HF,Rahimzadeh G,Fazeli MR,etal.Evaluation of wound healing activities of kefir products 〔J〕.Burns,2012;38(5):719-23.

〔2015-11-27修回〕

(編輯郭菁/徐杰)

遼寧省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014410004)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金項(xiàng)目

劉馨(1977-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，副主任檢驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床腫瘤標(biāo)記物研究。

R57

A

1005-9202(2016)17-4163-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.012