吳　迪　李慎賢　胡　瑩　金鐘太　程　磊

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧　沈陽　110004)

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化濁通脈散對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥家兔血小板衍化生長(zhǎng)因子-a、-b表達(dá)的影響

吳迪李慎賢胡瑩金鐘太程磊

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧沈陽110004)

目的研究化濁通脈散對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(ASO)家兔的動(dòng)脈硬化斑塊中血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)-a、-b表達(dá)的影響。方法選純種新西蘭雄性白兔50只，隨機(jī)分為5組，每組10只：即正常組(A組)、模型組(B組)、化濁通脈散組(C組)、西洛他唑組(D組)、通塞脈片組(E組)，予高脂飲食及股動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)建立ASO家兔模型，檢測(cè)藥物干預(yù)前后家兔血脂的變化，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定藥物干預(yù)后家兔股動(dòng)脈標(biāo)本PDGF-a、PDGF-b的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果化濁通脈散能有效地降低血脂如總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，但升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)作用不明顯，可以顯著降低動(dòng)脈硬化斑塊中細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1表達(dá)的陽性率(P<0.01)。結(jié)論化濁通脈散具有保護(hù)動(dòng)脈血管內(nèi)膜，抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用。

化濁通脈散；動(dòng)脈粥樣硬化；血小板衍化生長(zhǎng)因子

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(ASO)是目前常見病、多發(fā)病。隨著人群老齡化和飲食結(jié)構(gòu)不合理，ASO發(fā)病率逐年上升。西藥多從抗凝、溶栓、降脂等方面治療著手，且對(duì)防治慢性病程的ASO尚缺乏滿意療效。當(dāng)今對(duì)于本病治療的最新方法是干細(xì)胞移植，但其安全有效性仍需長(zhǎng)期流調(diào)學(xué)觀察。本實(shí)驗(yàn)?zāi)MASO形成過程，以化濁通脈散進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前后家兔的血脂變化及動(dòng)脈硬化斑塊組織中血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)-a、-b的表達(dá)情況，闡明化濁通脈散治療ASO的作用靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康純種的新西蘭雄性白兔50只，10月齡，體重2.8～3.0 kg，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2009-0002。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物化濁通脈散組成：黃芪、金銀花、膽星、半夏、茯苓、白術(shù)、澤瀉、焦山楂、川芎、延胡索、水蛭，由三九藥業(yè)集團(tuán)提供，批號(hào)：0807021。通塞脈片，由江蘇南星藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：120509。西洛他唑片，由浙江大冢制藥有限公司提供，批號(hào)：120708T。膽固醇：由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽有限公司提供，批號(hào)：20120120。牛血清白蛋白注射液：由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20120106。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器①主要試劑：Triozol Reagent:美國Invitrogen Life technologies公司，引物合成：北京華大基因公司，熒光定量PCR試劑盒：大連寶生生物。血脂系列試劑由我院生化室提供。②主要儀器：德國Eppendorf5417R離心機(jī)，雅培ARCHITECTci8200全自動(dòng)生化免疫分析儀，小型臺(tái)式離心機(jī)(美國SIGMA,1-13)，高速冷凍離心機(jī)Sigma 31k5C型，美國PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra)，紫外分光光度計(jì)(英國UV-visible Spectrometer,UV300)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1分組與造模造模前以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，排除飲食異常者。1 w后隨機(jī)分為5組，每組10只：即空白組(A組)、模型組(B組)、化濁通脈散組(C組)，西洛他唑組(D組)，通塞脈片組(E組)，分籠飼養(yǎng)。正常組喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。其余4組自實(shí)驗(yàn)開始喂高脂飲食，每只每日在正常飼料中加膽固醇1 g、豬油5 g。第3天開始均在10%烏拉坦麻醉下由左側(cè)股動(dòng)脈插管，4F氣囊導(dǎo)管拖拉右側(cè)髂股動(dòng)脈8次，造成機(jī)械性內(nèi)膜損傷〔1〕。實(shí)驗(yàn)第7天B、C、D、E組，按文獻(xiàn)經(jīng)耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg 造成免疫性內(nèi)皮損傷〔2〕；A組注射等量生理鹽水。

1.4.2藥物治療從21～24周末，各組改為正常飲食，進(jìn)行藥物干預(yù)，C組予化濁通脈散按生藥7.2 g·kg-1·d-1，用量按70 kg成人用量3.3倍計(jì)算；E組予通塞脈片0.75片·kg-1·d-1，按60 kg體重成人每日用量20片計(jì)算；D組予西洛他唑片4.5 mg·kg-1·d-1，按60 kg體重成人的人兔體表換算公式計(jì)算，均混入飼料中喂養(yǎng)。

1.4.3各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定及方法血脂測(cè)定：各組動(dòng)物于造模前及治療后分別取外周靜脈血5 ml，均以2 500 r/min離心30 min，以取得血清，2 h內(nèi)應(yīng)用雅培全自動(dòng)生化免疫分析儀分別檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，比較各組數(shù)值造模前后的變化及各組之間的變化。

1.4.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PDGF-a、PDGF-b mRNA含量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將動(dòng)物用乙醚麻醉，解剖切取股動(dòng)脈血管多段，長(zhǎng)約0.2～0.3 cm，放到盛有1 ml Trizol的1.5 ml EP管中保存，制備實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，然后處死動(dòng)物。序列：GAPDH(105 bp)正義鏈：5' TGCCGCCTGGAGAAAG 3'；反義鏈：5' GACCTGGTCCTCGGTGTAG 3'；PDGF-a(252 bp)正義鏈：5' GCTGCGACCTTTGAGACA 3'，反義鏈：5' GCCCAGACTTGCGGACA 3'； PDGF(144 bp)正義鏈：5' TGCACCGCAACAAGCAC 3'，反義鏈：5' TGTAGCCGCCGTCACTCT 3'。操作步驟：參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA。采用紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定260 nm、280 nmOD值，二者比值在1.8～2.0之間，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：37℃，15 min，85℃，5 s。應(yīng)用ABI 7500 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃，0.5 min，1個(gè)循環(huán)，95℃，5 min，60℃，34 s，40個(gè)循環(huán)，95℃，15 s，60℃，1 min，95℃，15 s，1個(gè)循環(huán)。通過測(cè)定熒光強(qiáng)度而對(duì)PCR產(chǎn)物定量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1血脂系列檢測(cè)結(jié)果造模前各組血脂指標(biāo)比較無顯著差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，B組、C組、D組、E組與A組相比，TC、TG、LDL-C均升高(P<0.01)；C組、D組、E組與B組相比較TC、TG、LDL-C均較低(P<0.01)，HDL-C較B組升高，但無顯著差異(P>0.05)；D組、E組與C組相比較TC、HDL-C無顯著差異(P>0.05)，但TG、LDL-C高于C組(P<0.05)。說明化濁通脈散對(duì)調(diào)控TC、TG、LDL-C有顯著效果，見表1。

表1　各組動(dòng)物血脂指標(biāo)比較

與A組比較：1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.01；與C組比較：3)P<0.05，下表同

2.2RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與A組相比，B組、C組、D組、E組的PDGF-a、PDGF-b mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，與B組相比，C組、D組、E組的PDGF-a、PDGF-b mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，與C組相比，D組、E組的PDGF-a、PDGF-b mRNA表達(dá)水平略有升高(P<0.05)。見表2。

表2　各組PDGF-a、PDGF-b mRNA表達(dá)比較

3　討　論

動(dòng)脈硬化閉塞癥屬中醫(yī)“脈痹”、“脫疽〔1，3〕”、“血癖”范疇，在古典文獻(xiàn)中多有記載。如《外科理例》中記載了15例“脫疽”病例，就有“…年愈50亦患者，色紫黑，腳痛”?！锻饪普凇芬蔡岬剑骸胺蛎摼艺撸飧鴥?nèi)壞也。描述6例”脫疽中，就有“中年婦女，肥胖，生渴三載，右食指麻痹，月余后發(fā)黑”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病與飲食失節(jié)、臟腑虧虛、經(jīng)脈痹阻等有密切關(guān)系。飲食失節(jié)，膏粱厚味，損傷脾胃，濕濁內(nèi)生，痰癖互結(jié)，阻塞經(jīng)脈；或因年老體衰，氣血虧虛，運(yùn)行無力，脈絡(luò)癖阻，氣虛血癖，經(jīng)脈痹阻，氣血不達(dá)四末而發(fā)為“脈痹”；或因肝腎虧虛，氣竭精傷，腎水消灼，筋練骨枯，而成“脫疽”之癥。總之在ASO形成的病機(jī)中，脾失健運(yùn)，痰濕脂濁壅積，阻滯經(jīng)脈是其本，氣血淤滯不通，肢體失榮是其標(biāo)。本研究提出“痰、瘀、毒”互結(jié)病機(jī)新說。因飲食失節(jié)、臟腑虧虛、經(jīng)脈痹阻，致痰、濕、瘀久蘊(yùn)成毒，脾虛是發(fā)病基礎(chǔ)，痰、瘀、毒為主要病理因素。我們遵循“治病務(wù)求其本”的原則，以“祛痰化瘀通絡(luò)、健脾解毒化濕”為治療大法，在補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)上加減化裁成化濁通脈散(黃芪、川芎、水蛭、金銀花、膽南星、半夏、茯苓、白術(shù)、澤瀉、焦山楂、延胡索)。此方從中醫(yī)角度加強(qiáng)了古方的活血化瘀、化濁通脈作用；從西醫(yī)方面加強(qiáng)了古方抗凝血、抗血栓形成、降脂及抑制血管內(nèi)壁動(dòng)脈硬化板塊形成的作用。重用黃芪：補(bǔ)氣，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。川芎、水蛭：活血祛瘀，為臣藥。膽南星、半夏：祛痰泄?jié)嵬ńj(luò) 澤瀉：利水滲濕 焦山楂：消痰化瘀 金銀花：清熱解毒 延胡索：行氣止痛，行血中之氣，又能行氣中之血；共為佐藥。全方共同組成益氣化瘀通絡(luò)、健脾祛痰化濁之功。

高脂血癥作為動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的一種危險(xiǎn)因素〔1〕，已被大家確認(rèn)，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這點(diǎn)。TC、TG、LDL-C過高都是AS的危險(xiǎn)因子，LDL-C是致動(dòng)脈粥樣硬化的基本因素。LDL-C通過血管內(nèi)皮進(jìn)入血管壁內(nèi),在內(nèi)皮下滯留的LDL-C被修飾成氧化型LDL(ox-LDL),ox-LDL-C不能被正常LDL-C受體識(shí)別，而被巨噬細(xì)胞的清道夫受體識(shí)別而快速攝取，巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL后形成泡沫細(xì)胞,后者不斷地增多、融合,構(gòu)成了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心。ox-LDL可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的黏附分子、化學(xué)趨化分子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞毒素等，進(jìn)一步促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展〔2〕。而HDL-C因?yàn)樗芤瞥庵芙M織的膽固醇，轉(zhuǎn)運(yùn)給肝臟進(jìn)行分解代謝。HDL-C還可能通過抗炎、抗氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮功能而發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。被認(rèn)為有防治動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用。本實(shí)驗(yàn)研究證明化濁通脈散雖對(duì)HDL-C作用不明顯，但對(duì)TG、LDL-C有較明顯的抑制作用，亦減輕了以上LDL-C促動(dòng)脈粥樣硬化的作用，說明化濁通脈散可通過減低血脂來抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展。

在動(dòng)脈硬化發(fā)生過程中，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子，PDGF與其受體結(jié)合能促進(jìn)大量單核細(xì)胞聚集、黏附、增殖及向內(nèi)膜下遷移，形成單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞〔4〕。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PDGF，可以啟動(dòng)動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞(SMC)經(jīng)內(nèi)彈力膜的窗孔遷入內(nèi)膜，發(fā)生增生、轉(zhuǎn)化、分泌細(xì)胞因子以及合成細(xì)胞外基質(zhì)。SMC經(jīng)其表面的受體介導(dǎo)而吞噬脂質(zhì)，形成SMC源性泡沫細(xì)胞。可見PDGF在動(dòng)脈硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)提示此方通過降低PDGF-a、PDGF-b抑制AS發(fā)生、發(fā)展。

1徐建,郝文君,白小涓,等.阿托伐他汀對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2006;26(11):1550-1.

2隋萍,殷祿昌,劉曉紅.2型糖尿病患者合并下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥相關(guān)危險(xiǎn)因素分析〔J〕.中國當(dāng)代醫(yī)藥,2010;19(3):7-9.

3張凡帆,龐鶴.動(dòng)脈硬化閉塞癥中醫(yī)證候要素文獻(xiàn)分布研究〔J〕.北京中醫(yī)藥,2012;31(3)：172-4.

4李旭,邵明哲,范隆華.血小板衍化生長(zhǎng)因子及其受體在糖尿病下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥中的表達(dá)及意義〔J〕.復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011;38(40):303-9.

〔2015-04-11修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

遼寧省科技廳項(xiàng)目(201122520)

李慎賢(1952-)，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事周圍血管病研究。

吳迪(1985-)，女，醫(yī)師，碩士，主要從事周圍血管病研究。

R543.5

A

1005-9202(2016)17-4161-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.011