艾克巴爾·阿不都熱西提，程國杰，王晶，王磊

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830001）

FoxO1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足的相關(guān)性研究*

艾克巴爾·阿不都熱西提，程國杰，王晶，王磊

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830001）

目的探索FoxO1基因多態(tài)位點(diǎn)rs3751436、rs199728685、rs139436481與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足（ICTEV）的相關(guān)性。方法選取70例維吾爾族ICTEV患兒和30例正常健康兒童為研究對象，應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)研究實(shí)驗(yàn)對象rs3751436、rs199728685、rs139436481多態(tài)性位點(diǎn)基因型。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測維吾爾族ICTEV患兒和正常健康兒童肌肉組織FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析基因型分布頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)法分析FoxO1基因多態(tài)位點(diǎn)基因型、等位基因與ICTEV的相關(guān)性。結(jié)果維吾爾族ICTEV患兒肌肉組織中FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平與正常健康兒童比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，新疆維吾爾族ICTEV患兒與正常健康兒童的FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）?；蛐汀⒌任换蜿P(guān)聯(lián)分析表明，ICTEV組和正常健康兒童rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論維吾爾族ICTEV與FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)可能無相關(guān)性，但不能排除FoxO1與ICTEV的關(guān)聯(lián)性。

FoxO1；基因多態(tài)性；先天性馬蹄內(nèi)翻足

先天性馬蹄內(nèi)翻足（idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV）是一種常見的嚴(yán)重危害兒童健康的先天畸形，由足下垂、內(nèi)翻、內(nèi)收3個(gè)主要畸形綜合而成。ICTEV病因尚未明確，僅推測遺傳、環(huán)境、易感基因等因素可能影響胚胎發(fā)育而導(dǎo)致馬蹄內(nèi)翻足[1]。國外研究表明，血管發(fā)育異?？芍苯佑绊懠∪饧肮趋赖陌l(fā)育，ICTEV發(fā)病與幼兒血管發(fā)育異常有關(guān)[2]。FoxO1作為Forkhead蛋白家族中重要一員，在維持動(dòng)物血管穩(wěn)定和保持造血干細(xì)胞的健康方面發(fā)揮著重要作用[3]，實(shí)驗(yàn)顯示，缺失FoxO1的基因工程小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的血管畸形現(xiàn)象，致畸原因可能與FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)調(diào)控血管壁細(xì)胞分裂有關(guān)。新疆維吾爾族ICTEV發(fā)病率約為0.83‰，高于新疆漢族ICTEV發(fā)病率（0.43‰），維吾爾族ICTEV患者同胞發(fā)病率為15.69%，遺傳度為92.86%[4-5]。因此，以新疆ICTEV高發(fā)人群維吾爾族為研究對象，探討FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)多態(tài)性與維吾爾族ICTEV的關(guān)系，是進(jìn)一步了解ICTEV致病機(jī)制的有效手段。

1 資料與方法

1.1研究對象

選取2012～2014年新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)傷骨科收治的70例維吾爾族ICTEV患兒外周靜脈血、足部肌肉組織標(biāo)本，且所有患兒均符合骨科診療常規(guī)中ICTEV診斷標(biāo)準(zhǔn)（北京協(xié)和醫(yī)院編寫），經(jīng)X線和手術(shù)確診。其中，男性52例，女性18例；年齡（6.45±2.11）歲。同期收集正常健康兒童30例（維吾爾族20例、漢族10例），男性16例，女性14例；年齡（7.11±2.10）歲。所有血液、組織標(biāo)本采集均征得研究對象的知情同意，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取使用K3EDTA抗凝真空采血管采集ICTEV患兒、正常健康兒童外周靜脈血5ml，置入-20℃冰箱冷凍保存。運(yùn)用血液全基因組提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，核酸-蛋白分析儀測定260nm和 280nm處吸光值，計(jì)算全基因組DNA的濃度和純度。

1.2.2R NA提取運(yùn)用組織和細(xì)胞總RNA提取法提取ICTEV患兒組、正常健康兒童組足部肌肉組織的總RNA，溶于脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）水。使用美國Invitrogen公司莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-70℃冰箱冷凍保存、備用。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)正反向以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測FoxO1和內(nèi)參基因β-actin引物。見表1。

表1　引物設(shè)計(jì)

1.2.4rs3751436、rs199728685和rs139436481位點(diǎn)限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-R FLP）擴(kuò)增反應(yīng)總體系25μl，包括10×PCR緩沖液2.5μl，10 mmol dNTP混合液0.5μl，50 mmol MgCl20.8μl，正向引物（5μmol）1μl，反向引物（5μmol）1μl，DNA模板1μl，Platinum Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 18μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5min。

1.2.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物限制性酶切采用BstuⅠ限制性內(nèi)切酶對ICTEV患兒、正常健康兒童的rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)P擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化。在10μl酶切反應(yīng)體系中，取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入限制性內(nèi)切酶BstuⅠ0.5μl、10×buffer 1μl、去離子水3.5μl。37℃孵育過夜，用3%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型。

1.2.6qR T-PCR檢測FoxO1在維吾爾族ICTEV患兒和正常健康兒童肌肉組織中的基因轉(zhuǎn)錄水平按照Invitrogen公司Platinum SYBR Green qPCR Super MIX kit使用說明書加入所需試劑及引物。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)（注：βactin為內(nèi)參基因）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析基因型分布頻數(shù)是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，用χ2檢驗(yàn)法分析FoxO1基因多態(tài)位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率與ICTEV的關(guān)聯(lián)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139 436481位點(diǎn)分析結(jié)果

ICTEV患兒、正常健康兒童的rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BstuⅠ限制性內(nèi)切酶消化后，rs3751436位點(diǎn)有A、G 2種等位基因，3種基因型：AA、AG、GG；rs199728685位點(diǎn)有C、T 2種等位基因，2種基因型：CC、TT；rs139436481位點(diǎn)有C、T 2種等位基因，2種基因型：CC、TT。見圖1。

圖1　rs3751436、rs199728685和rs139436481位點(diǎn)PCR-RFLP電泳圖

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律，研究對象具有遺傳代表性。見表2。

表2　rs3751436、rs199728685和rs139436481位點(diǎn)基因型分布頻率的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.3ICTEV患兒組與正常健康兒童組rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)基因型、等位基因分布差異

rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率在ICTEV患兒組與正常健康兒童組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.4FoxO1在維吾爾族ICTEV患兒和正常健康兒童肌肉組織中的轉(zhuǎn)錄水平

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，新疆維吾爾族ICTEV患兒足部肌肉組織FoxO1基因與β-actin基因平均密度比值為（0.224±0.015），正常健康兒童足部肌肉組織FoxO1基因與β-actin基因平均密度比值為（0.937±0.026）。ICTEV患兒足部肌肉組織FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平低于正常健康兒童（t=4.201，P=0.017）。見圖2。

表3　ICTEV患兒組與正常健康兒童組中rs3751436、rs199728685和rs139436481位點(diǎn)基因型、等位基因分布差異的比較例（%）

圖2　維吾爾族ICTEV患兒和正常健康兒童足部肌肉組織中FoxO1基因的轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

先天性小兒馬蹄內(nèi)翻足是一種較為常見的先天畸形，患兒一出生即在神經(jīng)、肌肉、骨骼及軟骨等方面表現(xiàn)出病理變化，且難以矯正。目前，關(guān)于ICTEV的具體病因仍未明確，僅提示遺傳因素、環(huán)境、毒性物質(zhì)、易感基因、骨骼發(fā)育等可能導(dǎo)致ICTEV的發(fā)生[6-7]。相關(guān)研究表明，血管斷裂或者血管發(fā)育缺陷，可發(fā)生缺血或血栓導(dǎo)致缺氧，影響肢芽的形成，最后導(dǎo)致馬蹄內(nèi)翻足畸形[8-9]。

FoxO1是FoxO家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員，它既能促進(jìn)脂肪、血管等細(xì)胞的分化，又在細(xì)胞凋亡、DNA損傷/修復(fù)、血管形成和腫瘤發(fā)生等生物過程中發(fā)揮重要作用[10]。FoxO1作為機(jī)體重要的轉(zhuǎn)錄因子，受PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控，使其發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)，從而抑制FoxO1所調(diào)控的下游基因的表達(dá)，血管細(xì)胞基因譜顯示，F(xiàn)oxO1和FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子通過AKT/HIF通路對血管細(xì)胞增殖分化起負(fù)向調(diào)節(jié)，抑制血管形成[11-12]。此外，F(xiàn)oxO1同樣能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT或PI3K/PKB信號(hào)通路中的下游基因[13]，譬如：PI3K/AKT下游信號(hào)AKT-mTOR-p70s6k（促進(jìn)肌肉合成）、AKT-FoxOs-Atrogin-MuRF信號(hào)通路（抑制肌肉分解）[14-15]。在本研究中，維吾爾族ICTEV患兒的FoxO1基因相較于正常健康兒童下降，實(shí)驗(yàn)中筆者雖然未能發(fā)現(xiàn)FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)與新疆維吾爾族ICTEV存在關(guān)聯(lián)性，但結(jié)合以上研究成果，并不能排除其他FoxO1基因多態(tài)位點(diǎn)與ICTEV之間的相關(guān)性。

研究中，新疆維吾爾族ICTEC患兒足部肌肉組織中FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于正常健康兒童，F(xiàn)oxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。在FoxO1基因多態(tài)位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率與ICTEV相關(guān)性分析中，未能證明rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)與ICTEV存在相關(guān)性，其原因可能為：研究對象樣本量不足，未能檢測出關(guān)聯(lián)連鎖信號(hào)；FoxO1與ICTEV具有相關(guān)性，但rs3751436、rs199728685、rs139436481位點(diǎn)并非關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，可能存在其他未被發(fā)現(xiàn)的FoxO1基因SNP與ICTEC之間存在聯(lián)系。因此，在不排除FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平的變化而引起ICTEV發(fā)病的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大研究對象樣本量，并探索FoxO1基因其他未知SNP位點(diǎn)，是進(jìn)一步了解ICTEV致病機(jī)制的有效手段。

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（申海菊編輯）

Association betweenFOXO1gene polymorphisms and idiopathic congenital talipes equinovarus of Uighur from Xinjiang*

Aikebaer·Abudurexiti，Guo-jie Cheng，Jing Wang，Lei Wang
（The Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi，Xinjiang 830001，China）

Objective To investigate the association betweenFOXO1gene polymorphisms of rs3751436，rs199728685，rs139436481 and idiopathic congenital talipes equinovarus（ICTEV）of Uighur from Xinjiang. Methods There were 70 Uighur children with ICTEV and 30 normal controls in this study.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）was used to detect their genotypes of polymorphism loci rs3751436，rs199728685 and rs139436481.The qRT-PCR was performed to evaluate the mRNA levels ofFOXO1from the ICTEV patients and the normal controls.The Hard-Weinberg equilibrium for genotypic distribution was estimated by the goodness of fit χ2tests.The relationships of genotype frequency and allelic frequency ofFOXO1with ICTEV were analyzed by χ2tests.Results Compared with the normal controls，the ICTEV patients showed down-regulation ofFOXO1gene transcription（P＜0.05）.The result of goodness of fit χ2tests showed that the genotypic distribution of rs3751436，rs199728685 and rs139436481 of thetwo groups was in Hard-Weinberg equilibrium（P＞0.05）.There was no significant difference in the distribution of the genotype frequency or allelic frequency between both groups（P＞0.05）.Conclusions The rs3751436，rs199728685 and rs139436481 gene loci may not be associated with ICTEV of Uighur from Xinjiang，but the correlation betweenFOXO1and ICTEV could not be excluded.

FOXO1；gene polymorphism；idiopathic congenital talipes equinovarus

R 726.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.011

1005-8982（2016）17-0054-05

2015-02-05

國家自然科學(xué)基金（No：81160215）

程國杰，E-mail：king-2032169@163.com；Tel：18109913261