吳昊天，梁磊

（1.內(nèi)蒙古呼和浩特市第二中學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010010；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

人類Izumo4和Tssk6在精子頂體反應(yīng)前后的定位檢測(cè)*

吳昊天1，梁磊2

（1.內(nèi)蒙古呼和浩特市第二中學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010010；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

目的鑒定人Izumo4和Tssk6在精子頂體反應(yīng)前后的位置。方法在實(shí)驗(yàn)室自制小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗體，采用免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)頂體反應(yīng)前后Izumo4和Tssk6在人精子中所處的位置。結(jié)果頂體反應(yīng)前，經(jīng)抗HIS-Izumo4多克隆抗體處理的精子在頭部赤道靠上部位染色稍淺，而赤道上膜染色稍深，經(jīng)抗HIS-Tssk6多克隆抗體處理的精子在尾部和赤道靠上部位染色較深。頂體反應(yīng)后，經(jīng)抗HIS-Izumo4和抗HIS-Tssk6腹水處理過的精子頂體膜均明顯破裂且對(duì)3-氨基-9-乙基咔唑染色劑不顯色。結(jié)論Tssk6位于精子頭部的頂體內(nèi)部及精子尾部，Izumo4位于頂體外膜上。

Izumo4；Tssk6

頂體反應(yīng)是哺乳動(dòng)物受精的重要環(huán)節(jié)之一，直接導(dǎo)致精卵質(zhì)膜的融合，卵子上的CD9蛋白是精卵融合的必要分子，INOUE等[1]通過克隆技術(shù)在小鼠精子上發(fā)現(xiàn)類似的蛋白Izumo。在眾多參與哺乳動(dòng)物精卵融合的精子蛋白質(zhì)中，Izumo家族成員Izumo1-4、Tssk家族成員Tssk6被認(rèn)為與頂體反應(yīng)密切相關(guān)[2-4]。Tssk6在雄性睪丸組織中，特別是在睪丸中的精子上特異性表達(dá)的一個(gè)絲氨酸蛋白激酶家族成員，于精原細(xì)胞減數(shù)分裂后至精子細(xì)胞形成期間即開始表達(dá)，對(duì)于精子頂體、精子形態(tài)及其功能具有重要意義[5-7]。來自人和小鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，Tssk6在精子的頂體內(nèi)部和精子頭部前段均有表達(dá)[5]。Tssk6含有一個(gè)絲氨酸/蘇氧酸磷酸化激酶結(jié)構(gòu)域，可以通過影響絲狀肌動(dòng)蛋白（filamentous actin，F(xiàn)-actin）的聚合作用來影響Izumo蛋白在頂體反應(yīng)后的重新定位[3]。另有研究表明，大鼠和人的Izumo4蛋白在精子頂體反應(yīng)前位于精子頭部前端，頂體反應(yīng)后檢測(cè)不到Izumo4蛋白，據(jù)此推測(cè)雖然Izumo4并不是跨膜蛋白，但很可能參與精卵融合的某個(gè)重要環(huán)節(jié)[2]。

目前對(duì)于人Izumo4和Tssk6在頂體反應(yīng)前后的位置分布還不清楚，為此本實(shí)驗(yàn)使用自制的小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗體，通過免疫組織化學(xué)法對(duì)頂體反應(yīng)前后Izumo4和Tssk6在人精子中所處的位置分別進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1精液標(biāo)本的收集

人類正常精液樣本選取標(biāo)準(zhǔn)：精液體積2～5ml，顏色淡黃或灰白色，pH 7.2～7.8，30 min完全液化，密度≥20×106個(gè)/ml，活力A級(jí)≥25%，或A+B級(jí)≥50%，存活率≥50%，形態(tài)正?！?5%，白細(xì)胞< 1×106個(gè)/ml。

1.2主要試劑與工具酶

免疫組織化學(xué)法染色試劑盒購于武漢博士德公司，小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗體為本課題組自制。

1.3人Izumo4和Tssk6在精子中的定位檢測(cè)

頂體反應(yīng)發(fā)生前，在精子的頭部前端可以檢測(cè)到Izumo4的存在，而頂體反應(yīng)發(fā)生后則檢測(cè)不到，Izumo4雖不是跨膜蛋白，但對(duì)于精卵的順利融合卻至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)使用前期實(shí)驗(yàn)室自制的小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗體，通過免疫組織化學(xué)法，分別檢測(cè)頂體反應(yīng)前后Izumo4和Tssk6在人精子中所處的位置。

1.3.1頂體反應(yīng)前Izumo4和Tssk6在人精子中的位置①人類精液置于恒溫培養(yǎng)箱37℃完全液化，用美國Vitrolife公司的Sperm Grad和Sperm Rinse（90%和45%兩個(gè)濃度）梯度離心法純化精子。收集沉淀，加入1.5ml SpermRinse混勻后離心，將精子沉淀移至另一15ml離心管，加入1.5ml SpermRinse吹打混勻，取0.5μl樣本滴片，于顯微鏡下觀察精子的純化質(zhì)量及密度。②沉淀經(jīng)0.01 mol磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3次，適當(dāng)稀釋后涂片，干燥待用。③將干燥好的涂片放入固定液靜置25min，經(jīng)0.01mol PBS清洗3次，待用。④用含有1%Triton-100的PBS對(duì)已固定的精子進(jìn)行4℃過夜通透處理，PBS清洗3次后按照試劑盒說明書對(duì)精子進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色。

1.3.2頂體反應(yīng)后Izumo4和Tssk6在人精子中的位置①將純化后的活精子沉淀緩慢推入至1.5 ml Tyrode's buffer底部，于5%的二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h獲能。②抽提上游好的獲能精子，移至含有足量鈣離子載體A23187工作液，于5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h，發(fā)生頂體反應(yīng)。③頂體反應(yīng)后4℃、1000g離心5min，回收精子。④定位檢測(cè)步驟同1.3.1中②～④，按照即用型鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）免疫組織化學(xué)法試劑盒說明書對(duì)精子進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色。

2 結(jié)果

2.1精子頂體反應(yīng)前人lzumo4和Tssk6的定位

使用本實(shí)驗(yàn)室自制的腹水多克隆抗體對(duì)人精子進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色，選擇只經(jīng)SpermRinse處理的精子作為對(duì)照組，檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組無染色；經(jīng)抗HIS-Izumo4多克隆抗體處理的精子在頭部赤道靠上部位染色稍淺，而赤道上膜染色稍深。經(jīng)抗HIS-Tssk6多克隆抗體處理的精子在尾部和赤道靠上部位均染色較深。見圖1。

2.2人lzumo4和Tssk6在精子頂體反應(yīng)后的定位

人精子經(jīng)抗HIS-Izumo4和抗HIS-Tssk6腹水多克隆抗體處理、獲能，加入含有鈣離子載體的A23187工作液，頂體反應(yīng)發(fā)生后進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色，結(jié)果顯示，經(jīng)抗HIS-Izumo4和抗HIS-Tssk6腹水處理過的精子頂體膜均明顯破裂，且對(duì)3-氨基-9-乙基咔唑染色劑不顯色。見圖2。

圖1　人精子細(xì)胞中Izumo4和Tssk6的免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)

圖2　頂體反應(yīng)后人精子細(xì)胞中Izumo4和Tssk6的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用純化過的Izumo4和Tssk6腹水多克隆抗體對(duì)人精子做免疫細(xì)胞化學(xué)分析，經(jīng)過通透處理后的精子在赤道段至頂體部分有較明顯的識(shí)別染色。頂體反應(yīng)發(fā)生前的人精子頂體上存有大量Tssk6蛋白，Izumo4相對(duì)較少且只明顯存在于精子頭部頂體外膜之上，而頂體反應(yīng)后無法檢測(cè)到Izumo4，該結(jié)果與前人對(duì)小鼠的研究相符[2]。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，人精子頂體反應(yīng)發(fā)生前，Tssk6明顯分布于精子的整個(gè)頂體及尾部位置，而Izumo4則只分布于頂體膜上[8-9]。頂體反應(yīng)發(fā)生后在精子頭部沒有檢測(cè)到Izumo4和Tssk6，可能是隨著頂體反應(yīng)的結(jié)束，頂體膜破裂且內(nèi)含物釋放出來，位于頂體位置的Izumo4和Tssk6亦同時(shí)流出。筆者認(rèn)為，雖然Izumo4并不是跨膜蛋白，但似乎與Tssk6通過某種作用被鎖定在頂體外膜上，而Tssk6大量分布于精子頂體內(nèi)的結(jié)果亦說明Izumo4和Tssk6并不在精子表面產(chǎn)生。頂體反應(yīng)發(fā)生后,在精子尾部未檢測(cè)到Tssk6，可能是由于在獲能過程中，精子尾部的F-actin要將磷脂酶C從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到精子膜上，之后F-actin必須被降解才能使精子向卵子接近完成后續(xù)過程?？紤]到Tssk6對(duì)肌動(dòng)蛋白的聚合作用產(chǎn)生影響，筆者認(rèn)為，頂體反應(yīng)完成后，由于精子尾部的鞭毛不再需要具備活動(dòng)能力，Tssk6隨著F-actin的降解而降解，因此在精子尾部無法檢測(cè)到Tssk6。

綜上所述，筆者確定Izumo4和Tssk6蛋白并不直接于人精子表面分泌。Tssk6應(yīng)該位于精子頭部的頂體內(nèi)部及精子尾部，Izumo4位于頂體外膜上。目前對(duì)于Izumo4和Tssk6蛋白在精子頂體內(nèi)的存在方式還不清楚，兩者與同樣位于精子表面及頂體內(nèi)的其他參與質(zhì)膜融合的蛋白分子的關(guān)聯(lián)作用亦不明確，還需要對(duì)Izumo4和Tssk6蛋白在精子上的相互作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

[1]INOUE N,IKAWA M,ISOTANI A,et al.The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs[J]. Nature,2005,434(7030):234-238.

[2]ELLERMAN D A,PEI J,GUPTA S,et al.Izumo is part of amultiprotein family whose members form large complexes on mammalian sperm[J].Mol Reprod Dev,2009,76(12):1188-1199.

[3]SOSNIK J,MIRANDA P V,SPIRIDONOV N A,et al.Tssk6 is required for Izumo relocalization and gamete fusion in the mouse[J]. J Cell Sci,2009,122(15):2741-2749.

[4]GUPTA S K.Unraveling the intricacies of mammalian fertilization[J]. Asian J Androl,2014,16(6):801-802.

[5]SU D,ZHANG W,YANG Y,et al.c.822+126T>G/C:a novel triallelic polymorphism of the TSSK6 gene associated with spermatogenic impairment in a Chinese population[J].Asian J Androl, 2010,12(2):234-239.

[6]JHA K N,WONG L,ZERFAS P M,et al.Identification of a novelHSP70-binding cochaperone criticalto HSP90-mediated activation of small serine/threonine kinase[J].J Biol Chem,2010, 285(45):35180-35187.

[7]LI Y,SOSNIK J,BRASSARD L,et al.Expression and localization of five members of the testis-specific serine kinase(Tssk) family in mouse and human sperm and testis[J].Mol Hum Reprod,2011,17(1):42-56.

[8]WANG P,HUO H L,WANG S Y,et al.Cloning,sequence characterization,andexpressionpatternsofmembersofthe porcine TSSK family[J].Genet Mol Res,2015,14(4):14908-14919.

[9]SINGARAVELU G,RAHIMI S,KRAUCHUNAS A,et al.Forward genetics identifies a requirement for the izumo-like immunoglobulin superfamily spe-45 gene in caenorhabditis elegans fertilization[J].Curr Biol,2015,25(24):3220-3224.

（童穎丹編輯）

Orientation of human Izumo4 and Tssk6 before and after sperm acrosome reaction*

Hao-tian Wu1，Lei Liang2
（1.The Second High School of Huhhot，Huhhot，Inner Mongolia 010010，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Huhhot，Inner Mongolia 010018，China）

Objective To survey Izumo4 and Tssk6 positions before and after sperm acrosome reaction. Methods Anti-mouse polyclonal antibodies were made against Izumo4 and Tssk6 in our laboratory.Using immunohistochemical method，Izumo4 and Tssk6 positions in human sperms were detected before and after the acrosome reaction.Results Before the acrosome reaction，the sperms treated by anti-HIS-Izumo4 polyclonal antibody were stained light in the head above the equator，and a little deeper in the membrane on the equator；those treated by anti-HIS-Tssk6 polyclonal antibody had deep stain in the tail and above the equator. After the acrosome reaction，the acrosome membrane was broken in the sperms treated with ascites containing anti-HIS-Izumo4 and anti-HIS-Tssk6 antibodies and could not be stained by 3-amino-9-ethylcarbazole. Conclusions Tssk6 should be located in acrosome of sperm head and in sperm tail，while Izumo4 is located on the outer membrane of sperm acrosome.

Izumo4；Tssk6

Q78；Q482

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.009

1005-8982（2016）17-0045-04

2016-04-07

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年創(chuàng)新基金（No：YKD2013QNCX029）

梁磊，E-mail：45976953@qq.com；Tel：18904715259