朱勇，王萍

（1.錦州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院ICU，遼寧錦州121001；2.錦州醫(yī)科大學，遼寧錦州121001）

基質(zhì)金屬蛋白酶-9和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2在哮喘中的表達及其與CCR3/RANTES信號軸的關(guān)系*

朱勇1，王萍2

（1.錦州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院ICU，遼寧錦州121001；2.錦州醫(yī)科大學，遼寧錦州121001）

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ER K1/2）在哮喘中的表達水平，并進一步探討兩者與CCR 3/R ANTES信號軸的關(guān)系。方法復(fù)制小鼠哮喘模型，分為對照組、哮喘組、干預(yù)組。3組小鼠處死后進行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液，對各細胞進行計數(shù)，取右肺葉進行蘇木精-伊紅染色法染色，免疫熒光法檢測CCR 3在支氣管上皮細胞的表達。體外實驗分別用活化正常T細胞表達分泌的調(diào)節(jié)蛋白（R ANTES）及R ANTES+SB328437刺激16HBE細胞，明膠酶譜法檢測MMP-9的活性；用R ANTES及R ANTES+PD98059（ER K1/2阻斷劑）刺激16HBE細胞，Western blot檢測ER K1/2、pER K1/2及MMP-9的表達水平。結(jié)果體內(nèi)實驗結(jié)果證明成功復(fù)制哮喘小鼠模型。通過蘇木精-伊紅染色法及計數(shù)肺泡灌洗液中各細胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，哮喘組小鼠氣道周圍有明顯的炎癥細胞聚集，而干預(yù)組小鼠氣道周圍的炎癥細胞明顯減少。通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠支氣管上皮細胞大量表達趨化因子CCR 3。體外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘組小鼠MMP-9的活性升高，而干預(yù)組MMP-9的活性下降。用外源性R ANTES刺激16HBE細胞后發(fā)現(xiàn)，R ANTES可以誘導高水平MMP-9的表達，而加入ER K1/2阻斷劑PD98059后30min，檢測MMP-9的表達量明顯降低。結(jié)論在哮喘疾病中，CCR 3/R ANTES信號軸通過ER K通路來調(diào)節(jié)MMP-9的表達。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；哮喘；CCR 3/R ANTES

支氣管哮喘是一種以氣道炎癥及氣道重塑為主要病理表現(xiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，其病理機制復(fù)雜，至今仍未完全闡明[1-2]?；|(zhì)金屬蛋白酶是一種鈣、鋅依賴的內(nèi)肽酶超家族，能夠降解膠原、彈性蛋白酶等大部分細胞外基質(zhì)，而其中降解細胞外基質(zhì)的主要限速酶為基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）。當哮喘患者急性發(fā)作時，不僅炎癥細胞會產(chǎn)生MMP-9，肺組織細胞和支氣管上皮細胞也大量表達MMP-9，使其表達水平明顯上升。其與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）的平衡作用在氣道壁基質(zhì)沉積和結(jié)構(gòu)重塑中尤為重要。目前研究認為，在氣道重塑中MMP-9發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]?；罨細胞表達分泌的調(diào)節(jié)蛋白（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）是由淋巴細胞、上皮細胞、嗜酸性粒細胞等多種細胞分泌的成熟蛋白，屬于CC家族趨化因子成員，可以與CCR1、CCR3、CCR4及CCR5結(jié)合，對淋巴細胞、嗜酸性粒細胞及嗜堿性粒細胞發(fā)揮趨化作用[5-6]，并且RANTES還能協(xié)同抗原共同刺激T淋巴細胞，促進T細胞的增殖和白介素-2（Interleukin-2，IL-2）的產(chǎn)生，特異性的趨化嗜酸性粒細胞和記憶性T淋巴細胞[7-8]。嗜酸性粒細胞是引起哮喘炎癥反應(yīng)的一種重要的效應(yīng)細胞[9]。氣道周圍有大量的嗜酸性粒細胞積聚，其在哮喘的發(fā)病中起重要作用[10]，但是調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞向炎癥部位募集是一個復(fù)雜的機制。因此，筆者通過實驗研究CCR3/RANTES信號軸的下游通路，為揭示哮喘的發(fā)病機制及免疫治療提供方向。

1 材料與方法

1.1實驗試劑

卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）購自美國Sigma公司，MMP-9（ab38898）和CCR3（ab115285）抗體購自英國Abcam公司，Anti-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellularsignal-regulatedproteinkinase1/2，ERK1/2）（V1141）購自美國Cell signaling公司，PD98059（S1177）購自美國Selleck公司，SB328437（559406）購自德國默克公司，16HBE細胞為本實驗室凍存細胞株，Recombinant Human RANTES（14-8970-80）購自美國Ebioscience公司。

1.2小鼠模型的復(fù)制

18只雄性BALB/c小鼠（合格證號：SYXK-2002-0045）購自江蘇省揚州大學實驗動物中心，隨機分為對照組、哮喘組及干預(yù)組，哮喘組小鼠于飼養(yǎng)第1、7和21天在大腿內(nèi)側(cè)皮下注射OVA 100μl，第28天時，將小鼠進行乙醚麻醉1mg OVA滴鼻，1次/d，持續(xù)3 d；干預(yù)組小鼠在OVA滴鼻前1h皮下注射SB328437，其余操作同哮喘組；對照組小鼠注射液體及滴鼻液體全部用生理鹽水代替，處置同哮喘組。

1.3肺泡灌洗液的收集及細胞計數(shù)

小鼠麻醉后解剖，暴露氣管后進行氣管插管，用5ml生理鹽水進行灌洗，灌入后反復(fù)沖洗后回抽，將細胞懸液離心，進行姬姆薩染色，上清液收集后凍存，用于其他檢測。

灌注后取小鼠的肺臟右葉，多聚甲醛固定后常規(guī)脫水，石蠟包埋，5μm厚病理切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后封片，于光學顯微鏡下觀察。

1.5正常人支氣管上皮細胞系細胞的培養(yǎng)和傳代

細胞為本實驗室凍存細胞，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)細胞，待正常人支氣管上皮細胞系（normal human bronchial epithelial cell line，HBE）細胞生長至80%時進行傳代，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細胞，除去不貼壁的細胞后加入0.25%胰酶1ml，消化2min后觀察細胞形態(tài)。當細胞間隙增大、邊緣透亮時，加入含10%胎牛血清的達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）終止消化，吹打細胞成單個細胞懸液，離心后棄上清，用10%胎牛血清的DMEM吹打后分至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6免疫熒光法檢測16HBE細胞中CCR3的表達

取適量16HBE細胞（本實驗室凍存細胞株），PBS洗滌后，用4%甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，滴加封閉液室溫放置60min，去除多于液體后滴加一抗Anti-CCR3 antibody（1∶200），4℃過夜，PBS洗滌，滴加熒光FITC標記Goat Anti-Rabbit IgG（1∶200），室溫孵育60 min，PBS洗滌3次，滴加溴化丙錠復(fù)染，室溫40 min，PBS洗滌3次后熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51）下觀察。

1.7Western blot檢測蛋白含量

將2×105個16 HBE細胞均勻種于6孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞長滿80%時換不含血清的改良Eagle培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，使細胞生長同步于G0期，在同一時間點加入RANTES，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞。按照Western blot試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說明書提取總蛋白，測定蛋白濃度后，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，加熱5min，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入二抗標記，洗滌后曝光。

隆化縣政府應(yīng)打造縣級融資擔保平臺，整合各類涉農(nóng)資金，引入社會資金，為“政銀企戶?！睋；鹛峁┏掷m(xù)可靠的資金來源，支持當?shù)靥厣a(chǎn)業(yè)發(fā)展。以傳統(tǒng)肉牛養(yǎng)殖為主，農(nóng)業(yè)和林果產(chǎn)業(yè)為輔的“一主兩輔”產(chǎn)業(yè)發(fā)展架構(gòu)為基礎(chǔ)，通過提供信貸擔保、優(yōu)惠貸款的方式給予金融支持；通過技術(shù)和人才引進等方式，逐步提升產(chǎn)業(yè)層級，強化品牌意識和差異化生產(chǎn)，實現(xiàn)產(chǎn)品個性化、多樣化，提升產(chǎn)品附加值，打造具有隆化特色的優(yōu)勢競爭力產(chǎn)業(yè)；借助電商平臺將供應(yīng)鏈、產(chǎn)業(yè)鏈和產(chǎn)品鏈打通，以縣擔?；馂榛A(chǔ)，發(fā)展鏈式金融，打通產(chǎn)品銷售渠道，提升現(xiàn)有產(chǎn)業(yè)盈利空間，支持產(chǎn)業(yè)做大做強，形成規(guī)模效應(yīng)，帶動更多貧困戶脫貧致富。

1.8明膠酶譜法檢測MMP-9的活性

取方法1.3時凍存的上清液16μl，加入2×SDS上樣緩沖液進行電泳，結(jié)束后根據(jù)Marker所示位置進行切膠，將切下的膠置于洗脫液（2.5%Trion X-100）進行搖擺洗脫。每15min更換1次洗脫液，1 h后移至孵育液中孵育30 min，置于37℃孵箱中孵育過夜，結(jié)束后染色1h，用脫色液進行脫色，直至出現(xiàn)MMP-9的條帶。

1.9統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1哮喘模型的鑒定

CCR3阻斷劑SB328437對小鼠哮喘應(yīng)答的影響。哮喘組小鼠在最后一次OVA刺激后，有明顯的咳嗽、嗆咳、呼吸加快及紫紺等癥狀，而對照組小鼠無上述表現(xiàn)，干預(yù)組小鼠哮喘發(fā)作的癥狀不明顯。為進一步驗證哮喘模型復(fù)制是否成功，筆者取3組小鼠的肺組織進行HE染色，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠氣道周圍未見明顯的炎癥細胞，哮喘組小鼠氣道周圍有明顯嗜酸性粒細胞和巨噬細胞的浸潤，而干預(yù)組小鼠氣道周圍與對照組相比有少量炎癥細胞浸潤，但數(shù)量不多，說明哮喘模型復(fù)制成功，并且SB328437影響哮喘中氣道周圍炎癥細胞的聚集。見圖1。

圖1　小鼠肺臟HE染色（×200）

2.2CCR3在支氣管上皮細胞的表達

CCR3在支氣管哮喘中的支氣管上皮細胞發(fā)揮重要作用。筆者通過免疫熒光的實驗驗證支氣管上皮細胞上確實有CCR3的表達。見圖2。

2.3CCR3阻斷劑SB328437對小鼠哮喘應(yīng)答的影響

繼續(xù)對小鼠進行肺泡灌洗，將灌洗液中的細胞分別進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞及中性粒細胞的數(shù)量高于對照組，說明哮喘急性發(fā)作時，肺組織內(nèi)有大量炎癥細胞聚集；而干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞及中性粒細胞數(shù)量低于哮喘組，說明CCR3阻斷劑SB328437能減少肺組織內(nèi)炎癥細胞的聚集，進而減輕哮喘發(fā)作時的氣道反應(yīng)。見附表。

附表肺泡灌洗液中各細胞數(shù)量的比較（n=6，×104/L±s）

附表肺泡灌洗液中各細胞數(shù)量的比較（n=6，×104/L±s）

注：t1、P1值：對照組與哮喘組比較；t2、P2值：對照組與干預(yù)組比較；t3、P3值：哮喘組與干預(yù)組比較

組別細胞總數(shù)巨噬細胞嗜酸性細胞淋巴細胞中性粒細胞對照組42±638±84±16±25±1哮喘組236±3481±18103±2331±1225±5干預(yù)組98±1462±2025±518±48±2 F值128.52210.50288.47917.35670.068 P值0.0000.0010.0000.0000.000 t1值15.5774.57212.6225.89010.978 P1值0.0000.0000.0000.0000.000 t2值4.5032.5652.6722.8161.653 P2值0.0000.0220.0170.0130.119 t3值11.0742.0069.9493.0749.325 P3值0.0000.0630.0000.0080.000

圖2　支氣管上皮細胞免疫熒光圖（×400）

圖5　Western blot檢測ERK1/2、pERK1/2、MMP-9的表達

2.4CCR3阻斷劑SB328437對MMP-9活性的影響

由于在氣道炎癥和氣道重塑中MMP-9發(fā)揮重要作用，本實驗檢測MMP-9在3組小鼠肺泡灌洗液細胞中表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘組小鼠MMP-9的活性升高，而干預(yù)組MMP-9的活性則下降，低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義。提示MMP-9可能為CCR3/ RANTES信號軸的下游分子。見圖3。

圖3　明膠酶譜檢測MMP-9活性

2.5RANTES誘導MMP-9的表達

CCR3通過與RANTES結(jié)合，發(fā)揮對嗜酸性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的趨化作用。本實驗進一步觀察RANTES對MMP-9的作用，用外源性RANTES刺激16HBE細胞，檢測MMP-9的表達水平，發(fā)現(xiàn)可以誘導高水平的MMP-9表達，并呈時間依賴性。見圖4。

圖4　Western blot檢測MMP-9的表達

2.6RANTES刺激ERK1/2的表達

為進一步揭示CCR3/RANTES信號軸在哮喘中的機制，本實驗用外源性RANTES刺激16HBE細胞，用Western blot檢測ERK1/2和pERK1/2的表達水平，發(fā)現(xiàn)在外源性的RANTES刺激后，ERK1/2和pERK1/2表達水平升高，同時加入ERK1/2阻斷劑PD98059后30min檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-9表達量降低，提示ERK1/2信號通路參與CCR3/RANTES信號軸誘導MMP-9的表達。見圖5。

3 討論

隨著社會的發(fā)展，環(huán)境污染逐漸嚴重，哮喘的發(fā)病率越來越高，而哮喘的治療卻一直停留在應(yīng)用支氣管擴張劑或激素治療[11-12]。為揭示哮喘的發(fā)病機制，尋找治療哮喘的切入點，筆者通過體內(nèi)外實驗探索哮喘中的信號通路。雖然在哮喘的發(fā)病過程中，CCR3/RANTES信號軸的作用已經(jīng)得到證實[13-14]，但是其確切的機制仍不清楚，而MMP-9也在哮喘的氣道炎癥和氣道重塑中發(fā)揮著重要作用，所以在本研究中，筆者分別運用體內(nèi)、體外實驗的方法驗證CCR3/ RANTES信號軸和MMP-9在哮喘中的作用，探討CCR3/RANTES信號軸及MMP-9的下游信號分子。

首先，本實驗成功建立哮喘模型，并且通過病理切片和肺泡灌洗液的細胞計數(shù)證實哮喘急性發(fā)作時，肺組織內(nèi)有大量的炎癥細胞的聚集，而應(yīng)用CCR3阻斷劑可以減少炎癥細胞的數(shù)量，提示CCR3/RANTES信號軸在哮喘的急性發(fā)作中發(fā)揮著重要作用。當筆者對哮喘小鼠進行CCR3阻斷劑SB328437治療時發(fā)現(xiàn)，阻斷CCR3的表達能明顯抑制MMP-9分子的活性。為進一步探索在哮喘中CCR3/RANTES信號軸的下游分子，筆者在體外用外源性的RANTES刺激16HBE細胞，發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達水平明顯增高，而用CCR3阻斷劑SB328437共同刺激時，MMP-9的表達量明顯下降，提示MMP-9是CCR3/RANTES信號軸的下游分子。

ERK1/2是一種可以被IL-4、IL-13、IL-17等細胞因子激活的分子，并且在哮喘小鼠中，學者發(fā)現(xiàn)大量活化的ERK1/2，提示ERK1/2可能在哮喘的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不可或缺的作用。由于在很多細胞中ERK通路都可以調(diào)節(jié)MMP-9的表達，筆者猜測在哮喘中CCR3/RANTES信號軸也是通過ERK通路來調(diào)節(jié)MMP-9的表達[15-16]。在實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)RANTES并沒有促進ERK1/2的活化，但是增加ERK1/2的表達，并且當用ERK1/2阻斷劑PD98059后，CCR3/RANTES信號軸作用于MMP-9的表達明顯受到抑制，提示在哮喘中CCR3/RANTES信號軸的確是通過ERK通路來調(diào)節(jié)MMP-9的表達，但是在這個過程中，是否存有其他通路發(fā)揮作用，還需要進一步研究。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)在哮喘疾病中，CCR3/RANTES信號軸通過ERK通路來調(diào)節(jié)MMP-9的表達，為揭示哮喘的發(fā)病機制及免疫治療提供實驗依據(jù)。

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（童穎丹編輯）

Expressions of MMP-9 and ERK1/2 in asthmatic mice and their correlations with CCR3/RANTES*

Yong Zhu1，Ping Wang2
（1.ICU，the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China；2.Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China）

Objective To investigate the expressions of extracellular signal-regulated kinase 1/2（ERK1/2）and matrix metalloproteinase 9（MMP-9）in asthmatic mice and their relationships with CCR3/RANTES. Methods After the establishment of mouse model of asthma，the mice were divided into control group，asthma group and SB328437（a specific CCR3 antagonist）intervention group.The lungs of mice were lavaged with 5ml saline，andthebronchoalveolarlavagefluidwascollectedforcountingthenumberofmacrophages，eosinophils，neutrophils and lymphocytes.The right lungs were isolated and prepared for HE staining，the expression of CCR3 in bronchial epithelial cells was detected by immunofluorescence.The activity of MMP-9 was determined by gelatin zymography after 16HBE cells were stimulated by RANTES and SB328437；then the expressions of ERK1/2，pERK1/2 and MMP-9 were detected by Western blot after the stimulation by RANTES，and RANTES plus PD98059（a specific ERK inhibitor）.ResultsIn vivoexperiment showed that amouse model of asthma was successfully established，and there was obvious accumulation of inflammatory cells around the airway through HE staining and cell counting，while there were fewer inflammatory cells around the airway in the SB328437 intervention group，high expression of CCR3 was found in the bronchial epithelial cells by immunofluorescence.In vitroexperiments revealed that MMP-9 activity significantly increased in the asthma group，while it significantly decreased in the SB328437 intervention group.The exogenetic RANTES induced high expression of MMP-9，while 30 min after adding PD98059，the expression of MMP-9 was decreased.Conclusions The CCR3/RANTES signal axis regulates the expression of MMP-9 through ERK pathway in asthma.

MMP-9；ERK1/2；asthma；CCR3/RANTES

R 256.12

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.006

1005-8982（2016）17-0029-05

2016-01-12

遼寧省科技廳聯(lián)合基金（No：2015020355）

王萍，E-mail：983441262@qq.com