李大玉，梁大敏，束波，楊加偉，生欣，李長福，余春波，范芳

（遵義醫(yī)學(xué)院生化教研室，貴州遵義563099）

沉默DNA依賴蛋白激酶亞基對肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu DNA損傷修復(fù)功能的影響*

李大玉，梁大敏，束波，楊加偉，生欣，李長福，余春波，范芳

（遵義醫(yī)學(xué)院生化教研室，貴州遵義563099）

目的探討DNA依賴蛋白激酶亞基（DNA-PKcs）基因沉默后對肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu DNA損傷修復(fù)功能的影響。方法采用陽離子脂質(zhì)體法將shDNA-PKcs干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Bel-7402/5-Fu細(xì)胞，根據(jù)熒光細(xì)胞數(shù)計算轉(zhuǎn)染率，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qR T-PCR）及Western blot檢測DNA-PKcs的沉默效率；Western blot檢測TopoⅡ、γ-H2AX蛋白表達(dá)；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷法檢測細(xì)胞DNA合成。結(jié)果質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為67%；qR T-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，DNA-PKcs mR NA及蛋白水平的沉默效率分別為82.6%和71.8%；Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組TopoⅡ蛋白表達(dá)水平比對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），γ-H2AX蛋白表達(dá)水平比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷法結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組DNA合成率比對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論shDNA-PKcs干擾質(zhì)粒能下調(diào)Bel-7402/5-Fu細(xì)胞中DNA-PKcs、TopoⅡ蛋白的表達(dá)，抑制Bel-7402/5-Fu細(xì)胞DNA合成。

DNA依賴性蛋白激酶亞基；肝癌耐藥細(xì)胞/Bel-7402/5-Fu細(xì)胞；DNA損傷修復(fù)

DNA雙鏈斷裂（double-stranded breaks，DSBs），是細(xì)胞最嚴(yán)重的一種損傷，可導(dǎo)致細(xì)胞失去分裂增殖而死亡，是多數(shù)抗癌藥物殺死腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制。DNA依賴蛋白激酶亞基（DNA-dependent ki nase catalytic subunit，DNA-PKcs）是非同源重組修復(fù)（nonhomologous end-joining，NHEJ）途徑的核心成分，在許多DNA損傷修復(fù)途徑中扮演著重要角色，如NHEJ、VDJ重組。同時可以磷酸化許多修復(fù)基因和轉(zhuǎn)錄因子[1-2]。腫瘤耐藥與DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)有關(guān)[3]，本文將沉默DNA-PKcs的表達(dá)，將干擾質(zhì)粒shDNA-PKcs轉(zhuǎn)染Bel-7402/5-Fu肝癌耐藥細(xì)胞，檢測DNA-PKcs沉默后，對細(xì)胞DNA損傷修復(fù)功能的影響，以探討DNA-PKcs在肝癌耐藥的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

Bel-7402/5-Fu細(xì)胞株購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，PRNAi-U6.1-Neo shRNA質(zhì)粒購于百奧邁科生物科技有限公司，LipofectamineTM2000 Reagent購于美國Invitrogen公司，DNA-PKcs抗體購于美國Assay biotech公司，TopoⅡ抗體購于英國Abcam公司，γ-H2AX抗體購于美國ABGENT公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將Bel-7402/5-Fu細(xì)胞放在含有10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，取對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組與轉(zhuǎn)染分為空白對照組、脂質(zhì)體組、質(zhì)粒對照組、shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞接種于6孔板，每孔種5×105個細(xì)胞，融合度達(dá)到60%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。配制質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，并加入對應(yīng)孔中，每孔200μl，4～6h后換液。48h后熒光顯微鏡下計數(shù)，計算轉(zhuǎn)染率（每個視野下的熒光細(xì)胞個數(shù)/相同視野下的總細(xì)胞個數(shù)×100%）。

1.2.3實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測DNA-PKcs mR NA的表達(dá)水平總RNA的提取按TIANGEN公司總RNA提取試劑盒（離心柱型）說明書進(jìn)行，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物：DNA-PKcs正向引物5'-GTGACAAGGCAACTGTATGAGC-3'，反向引物3'-TTCTCTAAAAACACCAGCCACA-5'，擴(kuò)增片段長度163 bp；β-actin正向引物5'-TGACGTGG ACATCCGCAAAG-3'，反向引物3'-GGAGCGACAGG TGGAAGGTC-5'，擴(kuò)增片段長度206 bp，每個樣品DNA-PKcs mRNA表達(dá)量經(jīng)qRT-PCR檢測，PCR產(chǎn)物作熔解曲線分析，根據(jù)公式2-△△CT相對定量分析計算DNA-PKcs mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4Western blot檢測DNA-PKcs、TopoII、γ-H2AX蛋白表達(dá)提取各組細(xì)胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯法定量樣品蛋白含量。Western blot法檢測DNA-PKcs、TopoII、γ-H2AX蛋白在各組中的表達(dá)。

1.2.5EdU法檢測細(xì)胞DNA合成率細(xì)胞處理48 h后，按照廣州銳博5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，拍照。由綠光激發(fā)藍(lán)色熒光，由紫光激發(fā)紅色熒光。每組取5個視野，計數(shù)相同視野下EdU標(biāo)記細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)，計算DNA合成率。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1shDNA-PKcs質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

shDNA-PKcs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率約為67%。見圖1。

圖1　shDNA-PKcs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

2.2DNA-PKcs mRNA的表達(dá)水平

各組DNA-PKcs mRNA水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=74.404，P=0.000）。各組DNA-PKcs相對倍數(shù)變化比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=160.518，P=0.000）。shDNAPKcs實(shí)驗(yàn)組與空白對照組DNA-PKcs mRNA水平比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.919，P= 0.004），shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組mRNA水平高于空白對照組；shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組與空白對照組DNA-PKcs相對倍數(shù)變化比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 17.237，P=0.001），即shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組DNA-PKcs mRNA相對表達(dá)量低于空白對照組。DNA-PKcs mRNA水平的沉默效率為82.6%。見附表和圖2。

附表各組DNA-PKcs mRNA相對表達(dá)量比較（n=3±s）

注：?與對照組比較，P<0.01

DNA-PKcs相對倍數(shù)空白對照組23.133±0.16417.207±0.3371.000±0.000脂質(zhì)體組22.493±0.13516.630±0.4781.045±0.101質(zhì)粒對照組22.680±0.27417.047±0.6901.226±0.052 shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組26.013±0.562?17.537±0.4680.174±0.083?F值74.404160.518 P值0.0000.000組別DNA-PKcs mRNA β-actin mRNA

2.3DNA-PKcs、TopoII、γ-H2AX的蛋白表達(dá)水平

各組DNA-PKcs、TopoⅡ、γ-H2AX蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（DNA-PKcs：F=23.478，P=0.000；TopoⅡ：P=15.564，P=0.001；γ-H2AX：F=157.096，P=0.000）。shDNAPKcs實(shí)驗(yàn)組DNA-PKcs、TopoⅡ、γ-H2AX蛋白相對表達(dá)量與對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（DNA-PKcs：t=8.407，P=0.006；TopoⅡ：t= 5.225，P=0.017；t=12.348，P=0.003），表明shDNAPKcs實(shí)驗(yàn)組DNA-PKcs、TopoⅡ蛋白相對表達(dá)量低于空白對照組，γ-H2AX蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組。DNA-PKcs蛋白水平的沉默效率為71.8%。見圖3。

2.4DNA合成率

各組DNA合成率，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=49.296，P=0.000），而shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組DNA合成率與空白對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.290，P=0.003），即shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組DNA合成率低于空白對照組。可見DNA-PKcs的沉默可降低肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu DNA的合成。見圖4。

圖4　各組DNA合成率比較

3 討論

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，目前臨床常用手術(shù)結(jié)合放療和化療。但長期放療和化療后，容易出現(xiàn)耐藥，這可能與DNA損傷信號紊亂和DNA損傷修復(fù)有關(guān)[4-5]。很多因素均會引起DNA損傷。其中，由電離輻射、抗癌藥物（如阿霉素）等引起的DNA雙鏈斷裂是最嚴(yán)重的損傷。在哺乳動物細(xì)胞中，以DNA依賴蛋白酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）為核心組件的NHEJ途徑，在DNA雙鏈斷裂的修復(fù)中有著非常重要的作用[6-7]。

DNA-PKcs是DNA-PK的催化亞單位，位于染色體8ql1，由4 128個氨基酸組成的大分子量蛋白質(zhì)，相對分子量為470 kD，主要包括DNA斷裂結(jié)合區(qū)、催化功能區(qū)、Ku結(jié)合區(qū)3個功能區(qū)，屬于胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K）家族。DNA雙鏈斷裂后，DNA-PKcs結(jié)合到DNA斷裂末端，通過自身磷酸化，以及磷酸化下游蛋白，如Artemis、DNA ligase4、XRCC4和Cernunnos等完成DNA損傷修復(fù)[8-9]。DNA-PKcs能維持基因組的穩(wěn)定性，具有腫瘤抑制功能[10]。目前有研究[11]表明，下調(diào)DNA-PKcs表達(dá)能增加腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。有研究顯示，在耐藥的神經(jīng)膠質(zhì)瘤、口腔癌的放療患者中，發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs表達(dá)量增加[12]，表明放療和化療后，機(jī)體產(chǎn)生了耐藥性。另外，在一些耐藥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs表達(dá)和活性增加[13-14]。本實(shí)驗(yàn)已通過沉默DNA-PKcs發(fā)現(xiàn)耐藥蛋白P-gp表達(dá)降低，因此推測耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu耐藥性降低可能與DNA-PKcs沉默所致的P-gp下調(diào)有關(guān)。可能原因是DNA-PKcs介入到耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)所致。DNA-PKcs在某些耐藥細(xì)胞中表達(dá)增加和活性增強(qiáng)，提高了耐藥細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的能力，從而對抗化療藥物所致的DNA損傷而引起耐藥。本實(shí)驗(yàn)采用RNAi技術(shù)沉默DNA-PKcs，檢測肝癌耐藥細(xì)胞中γ-H2AX的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默后肝癌耐藥細(xì)胞中γ-H2AX明顯增加，說明DNA-PKcs沉默后能夠增加DNA的損傷。為了進(jìn)一步說明沉默DNA-PKcs后能增加DNA的損傷情況，本實(shí)驗(yàn)還檢測沉默后DNA的合成情況和TopoⅡ蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默后DNA合成降低，TopoⅡ表達(dá)也降低。以此可以推測沉默DNAPKcs后能增加DNA損傷，降低DNA損傷修復(fù)功能?？赡苁荄NA-PK為核心的NHEJ途徑在肝癌耐藥細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中有著重要的作用，DNA-PKcs是否還通過其他機(jī)制調(diào)節(jié)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu DNA損傷修復(fù)功能，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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（申海菊編輯）

Effects of DNA-PKcs gene silence on repair of damaged DNA in multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line Bel7402/5-Fu*

Da-yu Li，Da-min Liang，Bo Shu，Jia-wei Yang，Xin Sheng，Chang-fu Li，Chun-bo Yu，F(xiàn)ang Fan

（Department of Biochemistry，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563099，China）

Objective To investigate the effect of shDNA-PKcs on DNA damage repair function of the multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line Bel7402/5-Fu.Methods shDNA-PKcs plasmids were transiently transfected into Bel7402/5-Fu cells via cathodolyte liposome transfection method.Transfection efficiency was evaluated by calculating the fluorescent cells and silence efficiency was determined using qRTPCR and Western blot.qRT-PCR and Western blot were used to detect mRNA and protein expressions of TopoⅡand γ-H2AX.The cellular DNA synthesis was detected by 5-ethynyl-2'-deoxyuridine（EdU）.Results Transfection efficiency was 67%.qRT-PCR and Western blot results showed the efficiency of RNA and protein interference for DNA-PKcs was 82.6%and 71.8%.Western blot analysis showed that the protein expression of TopoⅡin the shDNA-PKcs group was significantly lower than that in the control group（P＜0.05），while γ-H2AX expression was higher than that of the control group（P＜0.01）.EdU detection results showed the DNA synthesis of the shDNA-PKcs group decreased compared with that of the control group（P＜0.05）. Conclusions shDNA PKcs interference plasmid can down-regulate the expressions of DNA-PKcs and TopoⅡand inhibit the DNA synthesis of Bel7402/5-Fu cells.

DNA-PKcs；Bel7402/5-Fu cell；DNA damage repair

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.004

1005-8982（2016）17-0019-04

2015-10-30

貴州省社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目（No：[2009]3066）；貴州省社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合SY（2013）3008]

范芳，E-mail：fanf1970@126.com