朱理輝，羅勇，廖文秋，張琍，李國慶

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院1.消化內(nèi)科，2.重癥醫(yī)學(xué)科，湖南衡陽421001）

MicroRNA-219-5p靶向E-鈣黏蛋白調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移

朱理輝1，羅勇2，廖文秋1，張琍1，李國慶1

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院1.消化內(nèi)科，2.重癥醫(yī)學(xué)科，湖南衡陽421001）

目的研究MicroR NA-219-5p（miR-219-5p）靶向E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。方法首先通過生物信息學(xué)方法，尋找與E-Cadherin結(jié)合特異性最好、穩(wěn)定性強(qiáng)的miR NAs。在30例肝癌組織和20例癌旁肝組織中，通過蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測E-Cadherin的表達(dá)水平；實時熒光定量PCR檢測（qR T-PCR）miR-219-5p表達(dá)，分析兩者之間的相關(guān)性。在高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞株中，qR T-PCR檢測miR-219-5p表達(dá)，Western blot檢測E-Cadherin、N-cadherin表達(dá)。采用Lipofectamine 2000將miR-219-5p模擬子（mimic）、抑制子（inhibitor）、陰性對照組（negative contral）轉(zhuǎn)染到肝癌HepG2細(xì)胞系，qR T-PCR檢測miR-219-5p表達(dá)，Western blot檢測E-Cadherin、N-cadherin的表達(dá)；Transwell方法檢測miR-219-5p表達(dá)改變對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)miR-219-5p與E-Cadherin結(jié)合最穩(wěn)定，且特異性最好。肝癌組織中miR-219-5p低表達(dá)、E-Cadherin高表達(dá)，而癌旁組織中miR-219-5p高表達(dá)、E-Cadherin低表達(dá)。高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中miR-219-5p高表達(dá)、E-Cadherin低表達(dá)而N-cadherin高表達(dá)，在低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中miR-219-5p低表達(dá)、E-Cadherin高表達(dá)而N-cadherin低表達(dá)（P<0.05）。miR-219-5p水平表達(dá)增高，引起E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin高表達(dá)；miR-219-5p表達(dá)下調(diào)，可引起E-Cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin低表達(dá)（P<0.05）；HepG2-miR-219-5p模擬子細(xì)胞株中侵襲細(xì)胞計數(shù)為（24±3）個/高倍鏡視野，明顯低于對照組細(xì)胞株（P<0.05）。結(jié)論miR NA-219-5p可通過靶向結(jié)合E-Cadherin，調(diào)控EMT信號通路，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

miR NA；肝癌；侵襲轉(zhuǎn)移；E-Cadherin；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，惡性程度高，容易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移，早期診斷困難。因此，臨床上大多數(shù)肝癌患者就診時，已處于臨床中晚期，預(yù)后較差[1]。目前，臨床上治療肝癌總的療效仍不理想，大多數(shù)患者治療失敗的原因是由于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[2-3]。目前針對肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制的研究，對于探索肝癌的臨床治療新方法和提高療效，具有重要的臨床和現(xiàn)實意義。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程。在胚胎的發(fā)育、炎癥、組織的重建、癌癥轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[4-5]，其主要的特征有：如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、β-catenin、角蛋白等表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞表型的N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白等表達(dá)上調(diào)，并且誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)等[6-7]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去極性，黏附能力下降，從而失去與基底膜的連接，獲得較高的遷移與侵襲能力，以及降解胞外基質(zhì)等能力[8]。EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，但有關(guān)EMT的調(diào)控分子機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在HCC臨床研究和動物實驗中，發(fā)現(xiàn)EMT的發(fā)生與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及化療藥物耐藥有關(guān)，在此過程中，許多microRNAs（miR）分子參與了EMT的調(diào)節(jié)[9]。本研究擬探討肝癌細(xì)胞中，miR調(diào)控E-Cadherin影響EMT與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1臨床標(biāo)本及資料

30例原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本及20例癌旁正常肝組織標(biāo)本均來自南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科住院患者活檢或手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本。原發(fā)性肝癌患者，男性19例，女性11例；年齡32~75歲，中位平均（55.5±7.2）歲。20例癌旁正常肝組織來源于肝組織活檢。所有病例均經(jīng)兩位高年資副主任以上職稱的病理醫(yī)生診斷，結(jié)果均證實準(zhǔn)確無誤。置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2細(xì)胞株

肝癌細(xì)胞系HepG2、人肝癌細(xì)胞低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MHCC97-L、人肝癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MHCC97-H均購自中南大學(xué)細(xì)胞中心。

1.3主要試劑

免疫組織化學(xué)SP法試劑盒為福州邁新生物公司產(chǎn)品，鼠抗人單克隆E-Cadherin、N-cadherin抗體、β-actin抗體、過氧化物酶標(biāo)記的二抗、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000均購自美國Santa Cruz公司，qRT-PCR試劑為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，Transwell侵襲試劑盒為美國Corning公司產(chǎn)品，Matrigel膠為美國B&D公司產(chǎn)品。

1.4生物信息學(xué)分析

E-Cadherin（CDH1）的靶miRNAs預(yù)測：通過miRwalk在線程序進(jìn)行，利用10個常用的生物信息學(xué)軟件對miRNA-CDH1之間的結(jié)合進(jìn)行預(yù)測和分析。預(yù)測與CDH1結(jié)合的最佳靶miRNA：通過mi-Randa在線程序進(jìn)行熱力學(xué)穩(wěn)定性評分以及序列保守性評分，對miRNAs-CDH1之間結(jié)合的特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行排序。

1.5qRT-PCR

首先采用Trizol法提取總RNA。PCR擴(kuò)增采用兩步法進(jìn)行。程序設(shè)定如下：95℃、30 s進(jìn)行1個循環(huán)；95℃、30s，60℃、30s，進(jìn)行40個循環(huán)。miR-219-5p的qRT-PCR引物，正向引物：5'-CCGCCCCGGGC CGCGGCUCC-3'，反向引物：5'-GCCCCCAAACCUCG AGCGGG-3'，由廣州銳博生物科技有限公司技術(shù)合成。在實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，實驗重復(fù)3管，取平均值。反應(yīng)體系如下：10μmol/L正向引物1μl；10μmol/L反向引物1μl；DNA模板2μl；ddH2O 8.5μl；2×SYBR Primix Ex TaqTMⅡ12.5μl；總反應(yīng)體系為25μl。

1.6蛋白免疫印跡法（Western blot）

提取細(xì)胞的總蛋白，Bradford法測蛋白濃度；蛋白樣品置于100℃水浴中變性5 min；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）電泳，設(shè)定電壓為100 V，時間約1～2 h；采用聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜三明治轉(zhuǎn)移法，轉(zhuǎn)膜電壓為100 V，時間為1 h；麗春紅溶液染色3～5 min；5%脫脂奶粉封閉，1～2 h；雜交袋中，加入5%的封閉液和一抗（濃度為1︰1 500），4℃冰箱中過夜；再與二抗結(jié)合（濃度1︰1 000）；暗室中壓上X線片，曝光約30～90 s，定影顯影、洗片，最后通過掃描儀進(jìn)行圖像掃描。

1.7Trasnwell實驗

采用Lipofectamine2000將miR-219-5p模擬子（mimic）、抑制子（inhibitor）、陰性對照組（negative contral）轉(zhuǎn)染到肝癌HepG2細(xì)胞系，獲得3個重組細(xì)胞株：HepG2-miR-219-5p mimic、HepG2-miR-NC、HepG2-miR-219-5p-inhibitor。具體步驟如下：培養(yǎng)細(xì)胞密度到3×105/孔，6孔板接種。細(xì)胞融合度達(dá)80%時，進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。Transwell侵襲小室實驗：①侵襲小室的預(yù)處理：首先將Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基按1︰100稀釋，將稀釋液用來浸泡侵襲小室。在侵襲小室上面加入100μl稀釋的基質(zhì)膠，紫外線消毒殺菌。②小室腔壓力的平衡：在小室的上腔中加入200μl、下腔中加入600μl的無血清培養(yǎng)基，平衡小室腔內(nèi)的壓力。③侵襲細(xì)胞計數(shù)：將侵襲小室取出，對膜上的細(xì)胞加無水乙醇進(jìn)行固定，結(jié)晶紫染色。將未侵入基質(zhì)的腫瘤細(xì)胞通過棉簽輕輕擦拭掉，未除掉即為已經(jīng)成功侵入基質(zhì)膠中的腫瘤細(xì)胞，計數(shù)10個高倍視野中（×20）侵襲細(xì)胞的數(shù)目，重復(fù)3次，取均值，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組均數(shù)的比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miRWalk預(yù)測CDH1（E-cadherin）基因的靶miRNAs

采用miRwalk在線程序?qū)DH1的靶miRNA進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個軟件當(dāng)中有5個以上預(yù)測到有20個miRNAs可與CDH1結(jié)合（見表1）。

2.2miRanda預(yù)測miRNA-CDH1的結(jié)合

上述20個靶miRNAs在miRanda軟件當(dāng)中的熱動力學(xué)穩(wěn)定性分值和序列保守性分值見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，符合條件的miRNAs（熱動力學(xué)穩(wěn)定性分值≤-0.1，序列保守性分值為0.5～0.7）有8個，其中，miR-219-5p與CDH1結(jié)合的熱動力學(xué)穩(wěn)定性得分最低，說明miR-219-5p-CDH1之間的結(jié)合穩(wěn)定性最高、特異性最好。

2.3肝癌組織中miR-219-5p與E-Cadherin表達(dá)的關(guān)系

30例肝癌組織中miR-219-5p平均表達(dá)水平低于20例癌旁肝組織，兩者表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而肝癌組織中E-Cadherin相對表達(dá)水平高于癌旁肝組織，經(jīng)t檢驗，兩者表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.354，P=0.000，見圖1）。說明肝癌組織中出現(xiàn)miR-219-5p低表達(dá)和E-Cadherin高表達(dá)，而癌旁肝組織中出現(xiàn)miR-219-5p高表達(dá)和E-Cadherin低表達(dá)。

2.4肝癌細(xì)胞中miR-219-5與E-Cadherin表達(dá)的關(guān)系

分析顯示在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97-H中miR-219-5p相對水平低于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97-L，高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97-H中E-Cadherin相對表達(dá)水平低于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97-L，高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97-H中N-cadherin相對表達(dá)水平高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97-L（見圖2）。說明肝癌細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，miR-219-5p可能通過調(diào)控E-Cadherin/N-cadherin的表達(dá)水平，與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.5miR-219-5p與E-Cadherin結(jié)合驗證

3個重組細(xì)胞株HepG2-miR-219-5p mimic、HepG2-miR-NC、HepG2-miR-219-5p-inhibitor中，HepG2-miR-219-5p mimic細(xì)胞株中miR-219-5p水平表達(dá)增高，而E-Cadherin表達(dá)水平下調(diào)，N-cadherin高表達(dá)；HepG2-miR-219-5p-inhibitor細(xì)胞株中miR-219-5p水平表達(dá)下調(diào)，而E-Cadherin表達(dá)水平上調(diào)，N-cadherin低表達(dá)（見圖3）。說明轉(zhuǎn)染miR-219-5p mimic后，miR-219-5p表達(dá)水平增高，下調(diào)E-Cadherin而N-cadherin上調(diào)；而轉(zhuǎn)染miR-219-5p inhibitor后，miR-219-5p表達(dá)水平下調(diào)，上調(diào)E-Cadherin而N-cadherin下調(diào)。說明miR-219-5p能和E-Cadherin的發(fā)生結(jié)合下調(diào)其表達(dá)水平，與EMT有關(guān)。

表1　預(yù)測的20個miRNAs可與CDH1結(jié)合

表2　預(yù)測的12個miRNAs的熱動力學(xué)穩(wěn)定性和序列保守性得分

圖1　肝癌和癌旁肝組織中miR-219-5p與E-Cadherin表達(dá)的關(guān)系

圖2　肝癌細(xì)胞中miR-219-5p與E-Cadherin、N-cadherin表達(dá)關(guān)系

2.6miR-219-5p下調(diào)E-Cadherin與肝癌侵襲能力變化

Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-219-5p mimic下調(diào)E-Cadherin后，結(jié)果顯示，HepG2-miR-219-5p mimic細(xì)胞株中侵襲細(xì)胞計數(shù)為（24±3）個/高倍鏡視野，明顯低于HepG2-miR-NC的（47±5）個/高倍鏡視野、HepG2的（51±5）個/高倍鏡視野，經(jīng)t檢驗，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.952，P=0.003，見表3和圖4）；HepG2-miR-219-5p-inhibitor細(xì)胞株中侵襲細(xì)胞計數(shù)為（97±8）個/高倍鏡視野，均明顯高于其他3組，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.856，P= 0.005，見表3和圖4）。

圖34　個細(xì)胞系中miR-219-5p與E-Cadherin表達(dá)關(guān)系

表3　不同肝癌細(xì)胞系的侵襲細(xì)胞計數(shù)

圖4　侵襲實驗檢測不同肝癌細(xì)胞系的侵襲能力（×200）

3 討論

惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特征是能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程是一個多基因、多步驟、多環(huán)節(jié)的動態(tài)變化過程[10]。該過程中涉及到復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過程：腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲、胞外基質(zhì)的重塑、腫瘤血管的發(fā)生以及機(jī)體的免疫狀態(tài)發(fā)生改變等環(huán)節(jié)[11]。肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移涉及到許多基因和蛋白分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的改變[12-14]。該基因和蛋白的調(diào)控受許多因素的調(diào)控，近年來，有關(guān)miRNA調(diào)控基因表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究已成為腫瘤研究當(dāng)中的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

EMT是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要分子事件之一，是一個復(fù)雜的動態(tài)發(fā)生的過程。其中，細(xì)胞骨架的重構(gòu)是EMT發(fā)生的早期事件，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞通過EMT獲得了間質(zhì)細(xì)胞的表型[15]。E-cadherin主要功能是維持細(xì)胞間緊密連接的完整性，阻止細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，因此，低表達(dá)E-cadherin的細(xì)胞往往可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[16]。N-cadherin是細(xì)胞間黏連的主要結(jié)構(gòu)性成分，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附和遷移[17]。

EMT與多種腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)，EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個重要步驟，在該過程當(dāng)中，許多miRNAs分子參與EMT的調(diào)節(jié)[18-20]。EMT也在肝癌轉(zhuǎn)移中具有重要作用，然而EMT對肝癌轉(zhuǎn)移的影響是多方面的。宋瑩等[21]發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長因子可能通過誘導(dǎo)Snail的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，與肝癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。隋承光等[22]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-100通過抑制mTOR的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，主要是通過上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，阻抑EMT過程的發(fā)生。

miRNA-mRNA之間的相互作用具有嚴(yán)格的互補(bǔ)結(jié)合的特點(diǎn)，通過相關(guān)軟件預(yù)測miRNA-mRNA結(jié)合，尋找特定的靶基因具有較好的可行性。本研究首先采用miRwalk在線程序，通過多個生物信息學(xué)軟件進(jìn)行聯(lián)合檢測，結(jié)合多個軟件的檢測結(jié)果具有“交集”性，則說明預(yù)測的可靠性較好[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRwalk在線程序?qū)DH1的靶miRNA進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個軟件當(dāng)中有5個以上預(yù)測到有20個miRNAs可與CDH1結(jié)合，符合條件的miRNAs有8個，其中，miR-219-5p與CDH1結(jié)合的熱動力學(xué)穩(wěn)定性得分最低，說明miR-219-5p-CDH1之間的結(jié)合穩(wěn)定性最高、特異性最好。

對于生物信息學(xué)結(jié)果需要進(jìn)行實驗驗證，本研究發(fā)現(xiàn)，30例肝癌組織中miR-219-5p平均表達(dá)水平低于20例癌旁肝組織中；而肝癌組織中E-Cadherin相對表達(dá)水平高于癌旁肝組織中。同時在肝癌細(xì)胞系中，研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，miR-219-5p可能通過調(diào)控E-Cadherin/N-cadherin的表達(dá)水平，與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

miR-219-5p是與E-Cadherin（CDH1）是否具有靶向結(jié)合，為本研究合成miR-miR-219-5p inhibitor和miR-miR-219-5p mimic以及陰性對照組，分別轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞，以觀察miR-miR-219-5p對CDH1的靶向調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2-miR-219-5p mimic細(xì)胞株中miR-219-5p水平表達(dá)增高，而E-Cadherin表達(dá)水平下調(diào)，N-cadherin高表達(dá)；HepG2-miR-219-5p-inhibitor細(xì)胞株中miR-219-5p水平表達(dá)下調(diào)，而E-Cadherin表達(dá)水平上調(diào)，N-cadherin低表達(dá)。說明轉(zhuǎn)染mimic后，miR-219-5p表達(dá)水平增高，下調(diào)E-Cadherin而N-cadherin上調(diào)；而轉(zhuǎn)染inhibitor后，miR-219-5p表達(dá)水平下調(diào)，上調(diào)E-Cadherin而N-cadherin下調(diào)。miR-219-5p可靶向結(jié)合E-Cadherin并下調(diào)其表達(dá)水平，與EMT有關(guān)。

E-cadherin能夠維持細(xì)胞間的緊密連接的完整性，阻止細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，其表達(dá)下調(diào)被證明是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的早期事件，低表達(dá)E-cadherin細(xì)胞往往可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[24]。N-cadherin是細(xì)胞間黏連的主要結(jié)構(gòu)性成分，介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附和遷移，N-cadherin在上皮惡性腫瘤中的表達(dá)往往上調(diào)，其高表達(dá)往往通過調(diào)控EMT而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。近年來研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin/N-cadherin在許多腫瘤中都存在異常表達(dá)，說明E-cadherin/N-cadherin在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[26-27]。

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-219-5p mimic后，miR-219-5p表達(dá)水平增高，下調(diào)E-Cadherin而N-cadherin上調(diào)；而轉(zhuǎn)染miR-219-5p inhibitor后，miR-219-5p表達(dá)水平下調(diào)，上調(diào)E-Cadherin而N-cadherin下調(diào)。同時通過transwell實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-219-5p mimic后侵襲細(xì)胞計數(shù)明顯低于HepG2-miR-NC、HepG2；轉(zhuǎn)染miR-219-5p inhibitor后細(xì)胞株中侵襲細(xì)胞計數(shù)明顯高于HepG2-miR-NC、HepG2。說明miR-219-5p上調(diào)，下調(diào)E-Cadherin而N-cadherin表達(dá)增加，抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移；而miR-219-5p下調(diào)，上調(diào)E-Cadherin而N-cadherin表達(dá)減少，抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。miR-219-5p靶向E-Cadherin調(diào)控EMT在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中有重要作用，針對E-Cadherin的分子靶向治療在臨床肝癌治療中可能有重要作用。

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（張蕾編輯）

MicroRNA-219-5p regulates EMT and inhibits invasion and metastasis of hepatoma cells by targeting E-cadherin

Li-hui Zhu1，Yong Luo2，Wen-qiu Liao1，Li Zhang1，Guo-qing Li1
（1.Department of Gastroenterology，2.Intensive Care Unit，the Second Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang，Hunan 421001，China）

Objective To investigate the molecular mechanism of microRNA-219-5p（miR-219-5p）targeting E-cadherin（CDH1）in the regulation of epithelial mesenchymal trasition（EMT），thus inhibiting the invasion and metastasis of hepatoma cells.Methods Bioinformatics methods were used to determine miRNAs with the best specificity and stability of binding to E-cadherin.The correlation between E-cadherin expression detected by Western blot，and miR-219-5p level by qRT-PCR in 30 hepatoma tissues and 20 normal tissues，respectively，was analyzed. miR-219-5p level was detected by qRT-PCR.E-cadherin and N-cadherin levels were detected by Western blot in high and low metastatic hepatoma cell lines.miR-219-5p mimic，inhibitor and negative control were transfected into HepG2 cell line by Lipofectamine 2000，miR-219-5p expression was detected by qRT-PCR and the expressions of E-cadherin and N-cadherin were detected by Western blot.And the effects of miR-219-5p expression change oninvasive and metastatic abilities were also tested by the transwell method.Results Bioinformatics methods showed that miR-219-5p was the best target miRNA with the highest specificity and stability for binding to E-cadherin. miR-219-5p had low expression and E-cadherin had high expression in the HCC，while miR-219-5p had high expression and E-cadherin had low expression in the paracancerous tissues.There were high expression of miR-219-5p，low expression of E-cadherin and high expression of N-cadherin in highly metastatic cell line MHCC97-H. There were low expression of miR-219-5p，high expression of E-cadherin and low expression of N-cadherin in low metastatic cell line MHCC97-L（P＜0.05）.Increased miR-219-5p caused E-cadherin down-regulation and N-cadherin up-regulation.miR-219-5p down-regulation caused E-cadherin up-regulation and N-cadherin down-regulation in HepG2-miR-219-5p-inhibitor cell line（P＜0.05）.The invasion cell count was（24±3）/HP in the HepG2-miR-219-5p mimic cells which was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）. Conclusions miRNA-219-5p can specifically bind to E-Cadherin and regulate the EMT signaling pathway，thus suppress the invasion and metastasis of hepatoma cells.

miRNA；hepatoma；invasion；metastasis；E-cadherin；EMT

R 573.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.18.005

1005-8982（2016）18-0022-08

2016-04-18

羅勇，E-mail：fordluo@qq.com