陳江曼，李永剛，王佳美，佟偉，任雨舒，李新

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧錦州121000）

人致病性呼腸孤病毒M3編碼蛋白純化及多克隆抗體制備*

陳江曼1，李永剛1，王佳美1，佟偉1，任雨舒1，李新2

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧錦州121000）

目的根據(jù)構(gòu)建的人致病性納爾遜海灣病毒（NBVs）M3基因片段質(zhì)粒，純化融合蛋白制備NBVs M3多克隆抗體。方法利用構(gòu)建的納爾遜海灣病毒（NBVs）M3基因質(zhì)粒Pris His MB-M3，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌（E. coil）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)過鎳柱親和層析法獲得Pris His MB-M3融合蛋白；將純化的融合蛋白作為抗原免疫家兔，獲得NBVs M3多克隆抗體；蛋白免疫印跡檢測（Western blot）蛋白準(zhǔn)確性以及多克隆抗體抗性。結(jié)果SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色檢測顯示：25℃、IPTG濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)12 h，Pris His MB-M3融合蛋白表達(dá)量最高；在咪唑濃度為MCAC-20、MCAC-40條件時洗脫下目的蛋白。用純化的融合蛋白免疫家兔制備抗體，Western blot驗證成功制備出NBVs M3多克隆抗體。結(jié)論成功獲得了靈敏性及特異性較高的納爾遜海灣病毒（NBVs）M3多克隆抗體，為進(jìn)一步研究該病毒的致病性提供了很高的應(yīng)用價值。

Pris His MB-M3質(zhì)粒；納爾遜海灣病毒（NBVs)；純化蛋白；多克隆抗體

納爾遜海灣病毒（Nelson Bay orthoreoviruses，NBVs）屬于膜融合正呼腸孤病毒，為具有大中小3類10分段的雙鏈RNA（dsRNA）：大基因組（L1～L3），中基因組（M1～M3）和小基因組（S1~S4）。該病毒顆粒近似球形，無囊膜，由直徑約70～80納米的二十面體衣殼雙包被[1]，可從多種物種中分離出來，例如爬行類動物、鳥類等。NBVs首先從澳大利亞果蠅中分離出來，超過40年以獨立形式存在，且不與任何疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)。然而，最近某些NBVs菌株已確定為人類呼吸道感染的病原體。從一些急性呼吸道疾病患者的體內(nèi)分離出的致病菌顯示，NBVs已經(jīng)進(jìn)化為人畜共患病的形式，且可在人類中傳播[2-7]。2007年日本學(xué)者從印尼巴厘島返回日本的急性呼吸道感染患者體內(nèi)分離出NBVs，并命名為Miyazaki-Bali/2007（MB）[8-9]。最近，TAKAHIRO等[10]首次利用質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，根據(jù)cDNA轉(zhuǎn)錄出NBVs對應(yīng)的10個全長的RNA基因組，并進(jìn)行NBV噬菌斑實驗驗證。本實驗受（日本大孤大學(xué)病毒復(fù)制實驗室）Laboratory of Viral Replication饋贈，并在已測序正確的M3基因片段質(zhì)粒（Pris HisMB-M3）的基礎(chǔ)上，純化NBVs M3融合蛋白，制備出特異性及靈敏性較高的NBVs M3多克隆抗體，為進(jìn)一步研究納爾遜海灣病毒提供了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

Pris His MB-M3質(zhì)粒（由Laboratory of Viral Replication饋贈），（E.coil）DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自大連寶生物工程有限公司，金屬螯合親和層析所用Ni+2-NTA瓊脂糖介質(zhì)購自QIAGEN公司，超濾離心管購自密理博中國有限公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）均購自北京索來寶科技有限公司，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma中國有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠抗體購自Invitrogen中國分公司。

1.2誘導(dǎo)NBVs M3融合蛋白表達(dá)條件

將Pris His MB-M3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至（E.coil）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)白斑篩選，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，次日挑取單個白色菌落，接種到含氨芐西林（100 mg/ml）的10 ml LB培養(yǎng)基中，37℃200 r/min勻速震蕩，待菌液搖至OD600值在0.6～0.8之間，設(shè)置不同溫度梯度（20℃、25℃、30℃及37℃），不同IPTG誘導(dǎo)濃度（0.1、0.3、0.5、0.7及1.0 mmol/L）的實驗組，分別在不同時間段（8～12 h）等量收集菌液，4℃、6 000 r/min離心5min，棄盡上清收集菌體，2ml 1×PBS完全重懸，冰浴超聲破碎菌體約2 min，直至菌液清亮，4℃離心，分別取上清及沉淀制樣，SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測。

1.3在大腸桿菌中大量誘導(dǎo)NBVs M3蛋白表達(dá)

根據(jù)上述實驗組結(jié)果對比，在25℃，IPTG濃度為0.3mmol/L條件下，誘導(dǎo)600ml OD600值約0.70的菌液12h，離心收集菌體，20ml PBS重懸沉淀，以1∶1 000比例加入苯甲基磺酰氟（PMSF）200μl混勻，冰浴上超聲直至菌液清亮，4℃、6 000 r/min離心30 min，棄凈上清，用20 ml Gu MCAC-0（20 mmol/L Na3PO3.12H2O，0.5mmol/L氯化鈉NaCl，6mol/L鹽酸胍，pH=7.9）完全溶解沉淀，4℃過夜，第2天6 000 r/min離心30min，取油性上清液經(jīng)過0.45μm濾器加入超濾離心管中，4℃、4 000 r/min離心，并用不含咪唑的MCAC-0緩沖液（20mmol/L Na3PO3.12H2O，0.5mmol/L氯化鈉NaCl，pH=7.9）逐漸置換，待替換為澄清液體后，應(yīng)用鎳柱親和層析法純化NBVs M3融合蛋白，緩慢過柱收集原液，分別用不同濃度的咪唑洗脫液（MCAC-20、MCAC-40、MCAC-60、MCAC-80、MCAC-100、MCAC-200及MCAC-500）緩慢過柱，收集流出液，用SDS-PAGE電泳考染檢測蛋白，并用MCAC-0置換咪唑濃縮蛋白至1ml。

1.4蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測純化的目的蛋白

分別取不同濃度咪唑洗脫下的融合蛋白，以未誘導(dǎo)的Pris His MB-M3大腸桿菌菌液作為對照，10% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（NC）膜上（15 V，2 h），TBST緩沖液洗膜3遍，浸入5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，第2天，待膜在TBST緩沖液中清洗3遍后，以5%脫脂奶粉稀釋的His抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗，分別在搖床上室溫孵育1h，ECL發(fā)光液顯影檢測。

1.5動物免疫制備多克隆抗體及抗性檢測

常規(guī)注射家兔，首次免疫劑量為每只100μg，將蛋白抗原與PBS充分融合后加入等體積的弗氏完全佐劑，于皮下多點注射；免疫兩周后加強(qiáng)注射，抗原與初次量相同，加入等體積的不完全佐劑混合，注射方式同上。此后分2次每隔2周加強(qiáng)1次，最后1次免疫10d后，全身取血，4℃離心分離血清，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。取濃縮的NBVs M3融合蛋白和未誘導(dǎo)的菌液行10%SDS-PAGE電泳，以制備的NBVs M3多克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗，方法同1.4，ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。

2 結(jié)果

2.1SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色檢測NBVs M3融合蛋白

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）提供的核酸序列，NBVs M3蛋白分子量約69Ku。不同梯度實驗組菌體超聲后SDS-SPAGE電泳檢測顯示，NBVs M3蛋白多存在于包涵體中，在25℃、誘導(dǎo)12 h、IPTG濃度為0.3 mmol/L時蛋白表達(dá)量最多。同時經(jīng)過NTA樹脂柱洗脫后檢測顯示，在咪唑濃度為MCAC-20、MCAC-40條件下可以洗脫下目的蛋白。見圖1~3。

圖1　SDS-PAGE電泳顯示25℃，超聲誘導(dǎo)12 h后NBVs M3融合蛋白少量以可溶形式存在

圖2　SDS-PAGE電泳顯示25℃，超聲誘導(dǎo)12 h后NBVs M3融合蛋白主要以非可溶形式存在，在IPTG濃度為0.3 mmol/L時蛋白含量最高

圖3　SDS-PAGE電泳檢測咪唑洗脫液

2.2Western blot檢測濃縮的NBVs M3融合蛋白

SDS-PAGE電泳顯示，在69Ku處有一明顯的條帶，與預(yù)期蛋白大小相符。結(jié)果證明，本實驗成功經(jīng)過Ni-NTA柱純化出NBVsM3融合蛋白。見圖4。

圖4　Western blot檢測MB-M3多克隆抗體抗性

2.3Western blot檢測NBVs M3多克隆抗體抗性

為了檢測多克隆抗體的特異性，采用蛋白免疫印跡方法，以純化的NBVs M3融合蛋白和未誘導(dǎo)菌液制樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后，以制備的NBVs M3多克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗，ECL液顯影后在69Ku處有一條明顯的印記，與NBVs M3蛋白大小預(yù)期值符合。見圖5。

圖5　Western blot檢測NBVs M3多克隆抗體抗性

3 討論

正呼腸孤病毒屬廣泛存在于自然界的生物中，可從多種生物體內(nèi)分離，但大部分生物感染該病毒后無明顯體征[11]，且對人的致病性無法確定。納爾遜海灣病毒作為膜融合正呼腸孤病毒，最近被證實[2，5]，可從急性呼吸道疾病的患者體內(nèi)分離出來，該致病性呼腸孤病毒的分離引起人類對正呼腸孤病毒潛在的新興傳染病的關(guān)注。正呼腸孤病毒根據(jù)在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞的能力分為促融合正呼和非促融合正呼，該病毒因含有獨特的RNA多聚酶，在宿主體內(nèi)可利用自身RNA逆轉(zhuǎn)錄酶合成的新mRNA作為新RNA和病毒蛋白質(zhì)合成的模板。病毒在復(fù)制正鏈的基礎(chǔ)上，通過自身RNA多聚酶翻譯成蛋白，合成負(fù)鏈，形成雙鏈RNA分子。此后，雙鏈RNA與蛋白外殼重新組裝，形成新的病毒粒子，致細(xì)胞破裂，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量病毒。有研究表明[12-13]，利用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，已從具有多個節(jié)段dsRNA的納爾遜海灣病毒中克隆出10個全長基因區(qū)段的cDNA；同時已證實NBVs可高效的結(jié)合多個獨立的病毒配體和細(xì)胞受體，從而為認(rèn)識正呼腸孤病毒的生物學(xué)提供新的視角。M3是NBVs的基因片段，其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白μN(yùn)S在感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胞漿中形成包涵體，在病毒顆粒的組裝中起著至關(guān)重要的作用。

本實驗利用構(gòu)建的His標(biāo)簽M3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。其中His標(biāo)簽，即多聚組氨酰，分子量相對較小，可特異性結(jié)合鎳離子，對融合蛋白的結(jié)構(gòu)影響小，在純化過程中不需要額外從融合蛋白中切除[14]。所純化的融合蛋白根據(jù)Western blot驗證，可直接進(jìn)行動物免疫。在實驗中值得注意是融合蛋白純化過程中受到多種外界因素的影響，如IPTG濃度、誘導(dǎo)時間及表達(dá)溫度等，不同的實驗梯度分組結(jié)果有很大的差異，與其他蛋白比較，此融合蛋白主要以非可溶形式存在，蛋白分子量為69Ku；梯度實驗組比較，在12h、25℃、0.3mmol/L IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)量最高；為檢測蛋白準(zhǔn)確性及多克隆抗體的抗性，利用Western blot進(jìn)行驗證，結(jié)果表明與預(yù)期相符。

根據(jù)以上結(jié)果表明，本研究在構(gòu)建的NBVs基因片段質(zhì)粒基礎(chǔ)上純化出預(yù)期大小的M3融合蛋白；并制備出特異性較高的NBVs M3多克隆抗體，為納爾遜海灣病毒以及正呼腸孤病毒對人類致病性的研究提供實驗基礎(chǔ)。

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（張蕾編輯）

Purification of human pathogenic reovirus M3 gene encoded protein and preparation of its polyclonal antibody*

Jiang-man Chen1，Yong-gang Li1，Jia-mei Wang1，Wei Tong1，Yu-shu Ren1，Xin Li2
（1.Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121000，China；2.The Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121000，China）

Objective To prepare an anti-NBVs（Nelson Bay orthoreoviruses）M3 polyclonal antibody according to the human pathogenic NBVs M3 gene.Methods NBVs M3 plasmid-Pris His MB-M3 was built and transformed into E.coli BL21（DE3）competent cells.Isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）was used to induce protein expression，the NBVs M3 fusion protein was obtained by the method of Ni-NTA agarose；at the same time，the purified fusion protein was utilized as an antigen to immunize rabbits to obtain anti-NBVs M3 polyclonal antibody.The accuracy of the protein and polyclonal antibody resistance were detected by Western blot.Results SDS-PAGE electrophoresis and Coomassie blue staining showed that when the induction was carried out with 0.3 mmol/L IPTG at 25℃for 12 h，the fusion protein expression was the highest.When the imidazole concentration was MCAC-20 and MCAC-40，the fusion protein could be obtained.Western blot showed anti-NBVS M3 polyclonal antibody was successfully prepared with strong specificity when the purified fusion protein was used to immune rabbits.Conclusions A highly sensitive and specific anti-NBVs M3 polyclonal antibody has been successfully obtained.It has a high application value for further study of the pathogenicity of the viruses.

Pris His MB-M3 plasmid；Nelson Bay orthoreoviruses（NBVs）；purified protein；polyclonal antibody

R 373.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.18.004

1005-8982（2016）18-0018-04

2016-04-15

遼寧醫(yī)學(xué)院領(lǐng)軍人物人畜共患病創(chuàng)新團(tuán)隊（No：173615007）；錦州醫(yī)科大學(xué)校長基金-奧鴻博澤研究生科技創(chuàng)新基金（No：AH2015020）

李永剛，E-mail：lygjo@hotmail.com；Tel：0416-4673418