趙起越 趙紅帥 劉保獻(xiàn) 王焱 駱昉

摘要：采用超聲萃取與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，建立了快速測(cè)定大氣顆粒物中甾醇類化合物的方法。甾醇類化合物用甲醇超聲萃取，濃縮后使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。采用Waters公司Atlantis C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm，3 μm）， 以乙腈和水混合流動(dòng)相梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了膽甾醇、豆甾醇、菜油甾醇及β谷甾醇的分離。并在APCIMS/MS MRM模式下定量檢測(cè)。在選取的實(shí)驗(yàn)條件下，方法回收率在80.3%97.7%之間，檢出限0.015 ng/m3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，日內(nèi)及日間測(cè)定精密度小于20%。本方法具有較好的準(zhǔn)確性及精密度，實(shí)際樣品的測(cè)試結(jié)果表明， 方法可以滿足大氣顆粒物中甾醇類化合物的定量分析要求。

關(guān)鍵詞 ：超聲萃取；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；大氣顆粒物；甾醇

1 引 言

甾醇是一類具有生物活性的物質(zhì)，廣泛存在于自然界中，與動(dòng)植物的新陳代謝密切相關(guān)[1，2]。大氣顆粒物中的甾醇類化合物主要包括膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇及β谷甾醇等。有關(guān)研究表明：膽甾醇可以作為城市大氣中烤肉等烹飪?cè)吹氖聚櫥衔?，而β谷甾醇可作為生物質(zhì)燃燒的有機(jī)示蹤化合物[3，4]，因此大氣顆粒物中甾醇類化合物的分析測(cè)定對(duì)顆粒物源解析工作非常重要。

甾醇的分析方法很多，主要有化學(xué)分析法、薄層色譜法、氣相色譜分析法及液相色譜分析法等。化學(xué)分析法（包括毛地黃皂甙法及酶法）只能測(cè)定甾醇的總量，薄層色譜法靈敏度和重現(xiàn)性較差，氣相色譜直接進(jìn)樣法進(jìn)樣口溫度過高，易造成目標(biāo)化合物的分解，液相色譜與紫外（Ultraviolet，UV）及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用法選擇性差，靈敏度較低[5，6]。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法（Gas chromatographymass spectrometry， GC/MS）是常用的甾醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)分析方法[7，8]，該方法使用衍生化試劑與樣品進(jìn)行衍生反應(yīng)，應(yīng)用質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）進(jìn)行測(cè)定。方法流程長(zhǎng)，試劑毒性大，檢測(cè)成本高，分析時(shí)間長(zhǎng)。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法無需衍生，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確，是進(jìn)行甾醇類物質(zhì)含量測(cè)定的有效方法，食品、動(dòng)物體中甾醇類化合物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)工作已經(jīng)開展[9，10]，但使用該方法進(jìn)行大氣顆粒物中甾醇類化合物的分析尚無文獻(xiàn)報(bào)道。在前人工作基礎(chǔ)上，本研究采用超聲萃取與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，建立了測(cè)定大氣顆粒物中4種甾醇類化合物的方法。測(cè)量精密度小于20%。相比氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析甾醇類化合物的方法，本方法更加快速、經(jīng)濟(jì)，靈敏，為大氣顆粒物中甾醇類化合物的分析提供了較好的技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀、Quattro Premier XE 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；TDZ5WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀離心機(jī)廠）；氮?dú)庹舭l(fā)儀（NEVAPTM111，美國(guó) Organomation Associates公司）

甲醇、二氯甲烷、正己烷和乙腈（色譜純，美國(guó)J T Baker公司），娃哈哈純凈水（市售），植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β谷甾醇（百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）。

2.2 樣品來源

2012年及2013年在北京市部分地區(qū)使用大流量采樣器采集大氣顆粒物樣品，濾膜為玻璃纖維及石英材質(zhì)，采樣流速1.13 m3 /min，采樣時(shí)間24 h，濾膜面積50.24 cm2。為了去除干擾，濾膜在采樣前，在馬弗爐中550℃加熱6 h以上，空白濾膜經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定不含有目標(biāo)化合物。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇及β谷甾醇固體，配成濃度為1000 μg/mL的甲醇儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋成0.01，0.05，0.1， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0和10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4 樣品前處理

截取6.1544 cm2帶有顆粒物樣品的濾膜加入5 mL甲醇超聲萃取兩次，離心分離后，在氮?dú)猸h(huán)境中濃縮至1 mL， 經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)行儀器分析。

2.5 色譜及質(zhì)譜條件

Atlantis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，Waters公司），流動(dòng)相：乙腈（A）和水（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，90%B；10～11 min，90%～100%B；11～12 min，100%～90%B。柱溫40℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣體積：50.0 μL。使用大氣壓化學(xué)離子源（Atmospheric pressure chemical ionization，APCI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）模式；電暈電流：2.0 μA；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h。在樣品測(cè)試前，使用調(diào)諧液校正質(zhì)量軸。

2.6 樣品測(cè)定

用針泵直接進(jìn)樣，確定了4種甾醇的質(zhì)譜分析參數(shù)，列于表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 萃取條件的選擇

3.1.1 萃取溶劑的選擇 考察甲醇、正己烷、二氯甲烷、正己烷二氯甲烷（1∶2， V/V）及甲醇與二氯甲烷不同比例混合溶劑（3∶2， 2∶1， 4∶1， V/V）對(duì)顆粒物樣品的萃取效果，結(jié)果見圖1。甲醇、二氯甲烷、正己烷等溶劑均可萃取顆粒物樣品中甾醇，但甲醇對(duì)4種甾醇萃取效率較高，另外，甲醇與流動(dòng)相互溶性很好，故選取甲醇做萃取溶劑。

3.1.2 萃取溶劑體積的選擇

用特制裁刀截取6.1544 cm2的帶顆粒物樣品的濾膜，比較加入萃取溶液體積為5 mL， 6 mL， 8 mL， 10 mL及12 mL的萃取情況。結(jié)果表明， 隨著萃取溶劑量的增加，目標(biāo)化合物萃取量有所增加，但體積加大，目標(biāo)化合物濃度會(huì)降低，濃度過低必須經(jīng)過濃縮才能測(cè)定，且溶液體積增加濃縮損失加大。綜合各種因素，發(fā)現(xiàn)5 mL溶劑可以較完全地萃取顆粒物中的4種甾醇類化合物，同時(shí)樣品經(jīng)濃縮后的濃度在定量分析范圍之內(nèi)，因此選取萃取溶劑體積5 mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.1.3 超聲萃取次數(shù)及時(shí)間 實(shí)驗(yàn)考察了超聲10， 20及30 min的萃取效果，比較了1次和2次、3次超聲的效率，發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)及次數(shù)的增加，萃取量增大。但超聲時(shí)間從20 min延長(zhǎng)至30 min時(shí)，萃取量增加很少，而花費(fèi)時(shí)間較多。超聲3次比2次萃取量大一些，但轉(zhuǎn)移、濃縮的損失也增加，因此選擇超聲2次、每次20 min萃?。ㄒ妶D2及圖3），回收率實(shí)驗(yàn)表明這種萃取可以滿足顆粒物中甾醇類化合物的分析要求（表3）。

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1 色譜柱的選取

甾醇類化合物分子極性較弱，可以選取反相色譜柱進(jìn)行分離。本研究比較了6種C18柱（Symmetry C18 ， Agilent Eclipse XDBC18， XTerra C18， Xbridge C18， Atlantis C18和Hypersil ODS柱）及1種C8柱（XTerra C8）對(duì)4種植物甾醇的分離情況。結(jié)果表明， 大多數(shù)色譜柱可以分離膽甾醇及β谷甾醇，不能分開菜油甾醇及豆甾醇。有文獻(xiàn)報(bào)道在使用乙腈/異丙醇做流動(dòng)相時(shí)，Waters Symmetry C18色譜柱近1 h可分開上述兩種化合物，但考慮異丙醇粘度較大，不適于做質(zhì)譜分析[11]。本實(shí)驗(yàn)采用Atlantis C18色譜柱， 在乙腈、水做流動(dòng)相時(shí)， 對(duì)4種甾醇類化合物實(shí)現(xiàn)了較好的分離，尤其是菜油甾醇及豆甾醇的分離度較大，同時(shí)靈敏度也較高，優(yōu)于前期報(bào)道[9，11～15]。

3.2.3 色譜柱柱溫對(duì)分離的影響

柱溫是影響分離度及柱效的主要原因之一，溫度升高，溶質(zhì)和溶劑分子擴(kuò)散加快，且流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力減小，化合物容量因子變小?？疾炝酥鶞?5℃， 30℃， 35℃， 40℃， 45℃及50℃時(shí)4種甾醇的分離情況。4種甾醇化合物的容量因子隨柱溫變化如圖5所示。柱溫過高會(huì)損壞色譜柱填料，縮短柱子使用壽命。在同等分離效果下，綜合對(duì)色譜柱性能的保護(hù)和柱效的考慮，選擇40℃作為4種甾醇的分析的色譜條件。在此溫度下，甾醇化合物分離較好，靈敏度較高，且分析時(shí)間適當(dāng)（15 min內(nèi)完成分析）。

3.2.4 流速的選取

流速的選擇綜合了目標(biāo)化合物的分離、檢測(cè)靈敏度及色譜峰的保留時(shí)間來確定。本研究進(jìn)行了幾種流速（0.3， 0.5， 0.7和0.8 mL/min）的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在較低的流速（如0.3 mL/min）下4種甾醇的保留時(shí)間較長(zhǎng)，靈敏度較差。隨著流速的提高，保留時(shí)間逐漸縮短，檢測(cè)靈敏度提高。至流速達(dá)到0.8 mL/min時(shí)，難分離物質(zhì)對(duì)分離度適當(dāng)，靈敏度較好，保留時(shí)間也比較合適。綜合考慮各種因素，選擇0.8 mL/min的流速。

3.2.5 進(jìn)樣量的選取

分別選取5， 10， 15， 20， 30和50 μL樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，色譜峰響應(yīng)值會(huì)隨著進(jìn)樣量增加而增加，為保證有較高的分析靈敏度，最終選取進(jìn)樣量50 μL。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇

3.3.1 離子源及電離模式的選取

3.3.2 電暈電流強(qiáng)度的優(yōu)化 質(zhì)譜的電暈電流強(qiáng)度與檢測(cè)靈敏度有一定關(guān)系，本研究進(jìn)行了6種電流強(qiáng)度（1， 2， 3， 4， 5及6 μA）的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)電暈電流為2.0 μA時(shí)， 4種甾醇的信號(hào)強(qiáng)度最高，3.0 μA時(shí)次之，其余的條件較低（圖6），故選用2.0 μA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3.3 脫溶劑氣溫度的優(yōu)化 本研究考察了脫溶劑氣溫度400℃，500℃，600℃，800℃的分析效果，發(fā)現(xiàn)不同溫度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，其中以500℃為最好，最終選取500℃為脫溶劑氣溫度。

3.3.4 脫溶劑氣流速的優(yōu)化

質(zhì)譜的脫溶劑氣流速對(duì)分析靈敏度有一定影響，本研究進(jìn)行了6種氣流流速（400， 500，600，700，800及1000 mL/min）的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)脫溶劑氣流速600 mL/min時(shí)信噪比最高，測(cè)定靈敏度最好，故選用該條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖7）。

3.4 方法確證

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限 取2.3節(jié)配制的甾醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)組分的響應(yīng)值y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x（μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以10倍信噪比計(jì)算方法的定量限（LOQ），以3倍信噪比計(jì)算方法檢測(cè)限（LOD）列于表2。在給定的濃度范圍內(nèi)，4種甾醇的線性關(guān)系良好，檢出限與衍生氣相色譜法相當(dāng)[4]，可以滿足大氣顆粒物中甾醇類化合物的分析要求。

3.4.2 方法的準(zhǔn)確度

向大氣顆粒物樣品中添加3個(gè)濃度水平的4種甾醇類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成低、中及高濃度的加標(biāo)樣品，按照上述方法進(jìn)行前處理，每個(gè)濃度水平平行操作6次，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果列于表3。大氣顆粒物中4種甾醇類化合物的3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收率均大于80%，6個(gè)平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，方法準(zhǔn)確度符合有機(jī)分析要求。

3.4.3 方法的精密度 對(duì)兩種不同含量的大氣顆粒物樣品日內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，并進(jìn)行3日內(nèi)的重復(fù)測(cè)定，結(jié)果見表4。4種甾醇類化合物的日內(nèi)重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，3天的重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%，方法日內(nèi)及日間測(cè)定精密度較好。

3.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

使用上述方法，對(duì)北京城區(qū)采集的大氣顆粒物樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表5，分析譜圖如圖8。由表5可知，北京城區(qū)的大氣顆粒物樣品中可以檢測(cè)到4種甾醇類化合物，本方法滿足科學(xué)研究及監(jiān)測(cè)管理需求。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)大氣顆粒物樣品前處理方法進(jìn)行篩選，建立了大氣顆粒物中4種甾醇類化合物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。本方法不需衍生反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，分析快速，4種甾醇類化合物的加標(biāo)回收率大于80%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，方法檢測(cè)限能夠滿足大氣顆粒物中甾醇類物質(zhì)檢測(cè)分析的要求，適于大量樣品的分析監(jiān)測(cè)。使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析大氣顆粒物中的甾醇類化合物，拓展了環(huán)境中該類物質(zhì)分析的新思路，對(duì)后續(xù)的監(jiān)測(cè)管理工作提供了技術(shù)支持。

References

1 Naumoska K， Vovk I. J. Chromatogr. A， 2015， 1381： 229-238

2 Huang L Y， Cao Y Y， Xu H， Chen G N. J. Sep. Sci.， 2011， 34： 385-392

3 Fraser M P， Cass G R， Simoneit B R T. Atmos. Environ.， 1999， 33： 2715-2724

4 HE LingYan， HU Min， HUANG XiaoFeng， ZHANG YuanHang. Acta Scientiae Circumstantiae， 2005， 25（1）： 23-29

何凌燕， 胡 敏， 黃曉鋒， 張遠(yuǎn)航. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 25（1）： 23-29

5 Cimpoiu C， Hosu A， Hodisan S. J. Pharmaceu. Biomed. Anal.， 2006， 41（2）： 633-637

6 ZHANG LiXia， BI YanLan， ZHANG KangYi. Grain and oil Processing and Food Machinery， 2006， 2： 53-55

張麗霞， 畢艷蘭， 張康逸. 糧油加工與食品機(jī)械， 2006， 2： 53-55

7 GB/T252232010. Determination of the Content of Cholesterol and Total Cholesterol in Animal and Vegetable Oils. National Standards of the People′s Republic of China

動(dòng)植物油脂. 甾醇和總甾醇含量的測(cè)定. 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). GB/T252232010

8 YC/T4712013. Determination of Ergosterol in Tobacco and Tobacco Products. Occupational Standards of Tobacco Industry

煙草及煙草制品麥角甾醇的測(cè)定. 煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn). YC/T4712013

9 Igarashi F， Hikiba J， Ogihara M H， Nakaoka T， Suzuki M， Kataoka H. Anal. Biochem.， 2011， 419： 123-132

10 Hou C T， Wang R H， Zou Y Y， Song X N， Liu H X， Li F H， Xu L C. Food Sci.， 2013， 34（14）： 301-305

11 DAI Jun， CHEN ShangWei， FANG Tao， WANG LiPing， GU XiaoHong， TANG Jian. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（12）： 1725-1729

戴 軍， 陳尚衛(wèi)， 方 濤， 王立平， 顧小紅， 湯 堅(jiān). 分析化學(xué)， 2005， 33（12）： 1725-1729

12 Lu B Y， Zhang Y， Wu X Q， Shi J Y. Anal. Chim. Acta， 2007， 588： 50-63

13 Madawala S R P， Andersson R E， Jastrebova J A， Almeida M， Dutta P C. Pol. J. Food Nutri. Sci.， 2012， 62（3）： 159-169

14 XU WenLin， SHA Ou， QIAN JunHu， LU Ping. Journal of Instrumental Analysis， 2003， 22（6）： 98-100

許文林， 沙 鷗， 錢俊紅， 魯 萍. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2003， 22（6）： 98-100

15 Ito N， Hakamata H， Kusu F. Anal. Methods， 2010， 2： 174-179

16 DUAN YuanXing， ZHANG Tao， CHEN JinXiong， YANG GuangYu， LIU Wei， XU Yong， ZHANG Xia. Applied Chemical Industry， 2013， 42（5）： 955-957

段沅杏， 張 濤， 陳進(jìn)雄， 楊光宇， 劉 巍， 許 永， 張 霞. 應(yīng)用化工， 2013， 42（5）： 955-957

17 CaabateDíaz B， Carretero A S， FernándezGutiérrez A， Vega A B， Frenich A G， Vidal J L M， Martos J D. Food Chem.， 2007， 102： 593-598

Abstract A rapid analytical method was developed for the determination of 4 sterols in atmospheric particles by ultrasonic extraction coupled with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （HPLCMS /MS）. After extraction by methanol and enrichment， sterols were separated on an Atlantis C18 column （100 mm×2.1 mm， 3 μm） with acetonitrile and water served as mobile phase in gradient elution， then determined by HPLCMS/MS using atmospheric pressure chemical positive ionization （APCI+） and multiple reaction monitoring （MRM）. Parameters of chromatography and mass spectrometry， as well as conditions of ultrasonic extraction were optimized. The developed method provided good linearity （R>0.99） and high recoveries （80.3%-97.7%） for 4 sterols. Low detection limits were obtained as 0.015 ng/m3， with RSD less than 15% （n=6）. Comparing with GC/MS， this method was more rapid， sensitive and economical because the derivation was eliminated from the procedure， thus saving a lot of resources. Samples of atmospheric particles were detected using this method， and the results indicated that this method could meet the requirements for quantitative analysis of sterols in atmosphere.

Keywords Ultrasonic extraction； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Atmospheric particles； Sterol