初亞男 張婕妤 封利穎 周國(guó)華

摘要：采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)和改進(jìn)的全血基因組提取方法，建立了位于6號(hào)染色體的銀屑病易感基因1候選基因1（Psoriasis susceptibility 1 candidate 1，PSORS1C1）rs9263726位點(diǎn)的焦磷酸測(cè)序方法，檢出限達(dá)到0.4 ng/μL基因組DNA，20例標(biāo)本的焦磷酸法和Sanger法測(cè)序結(jié)果完全一致。利用本方法對(duì)683例標(biāo)本的rs9263726位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，得到中國(guó)人群該位點(diǎn)野生型（GG型）分布頻率為87.6%，突變的GA型分布頻率為11.7%、AA型分布頻率為0.7%。通過對(duì)隨機(jī)選取的46例標(biāo)本rs9263726位點(diǎn)與人類白細(xì)胞抗原基因HLAB*58∶01基因型的連鎖關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該位點(diǎn)預(yù)測(cè)HLAB*58∶01基因型的靈敏度為100%、特異性為91.3%。本方法可用于HLAB*58∶01基因型的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 ：人類白細(xì)胞抗原基因HLAB*58∶01； 焦磷酸測(cè)序； rs9263726位點(diǎn)； 基因型

1 引 言

別嘌呤醇被廣泛應(yīng)用于臨床高尿酸血癥的常規(guī)治療，但是其皮膚型不良反應(yīng)在用藥前無(wú)法預(yù)知，特別需要注意的是，發(fā)生不良反應(yīng)的人群中約有1%～5%為StevensJohnson綜合征（SJS，皮膚脫落小于體表面積的10%，死亡率為1%～5%），20%～30%為中毒性表皮壞死松解征（TEN，皮膚脫落大于體表面積30%， 死亡率25%～35%）[1，2]，急劇增加了患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。2005年， Hung等[3]發(fā)現(xiàn)，由于別嘌呤醇引發(fā)SJS/TEN的51位中國(guó)漢族人，全部含有人白細(xì)胞抗原基因HLAB*58∶01；2009年，Tassaneeyakul等對(duì)泰國(guó)人別嘌呤醇致敏的分析發(fā)現(xiàn)，HLAB*58∶01等位基因預(yù)測(cè)別嘌呤醇誘發(fā)的SJS/TEN過敏的靈敏度（含有HLAB*58∶01等位基因的標(biāo)本正確判定此標(biāo)本會(huì)發(fā)生別嘌呤醇誘發(fā)的SJS/TEN過敏反應(yīng)的比例）為100%，特異性（不含有HLAB*58∶01等位基因的標(biāo)本正確判定此標(biāo)本不會(huì)發(fā)生別嘌呤醇誘發(fā)的SJS/TEN過敏反應(yīng)的比例）為87%[4]。據(jù)最新dbMHC等位基因頻率數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，HLAB*58∶01等位基因的攜帶頻率歐洲為0.77%，北美洲為0.38%，大洋洲為2.5%，東北亞為6.1%，在世界不同地區(qū)人群中的攜帶頻率有顯著的差異。2010年國(guó)際組織相容性工作組報(bào)道華人攜帶率平均為8.8%～10.9%，遠(yuǎn)高于東北亞分布水平，因此中國(guó)漢族人群屬于別嘌呤醇引發(fā)SJS/TEN的高風(fēng)險(xiǎn)群體。

HLA目前的分型方法主要有3類：血清學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)分型法。其中血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)分型法，由于高特異性的抗體和特異的細(xì)胞獲取困難，且操作繁瑣，因此目前很少使用。分子生物學(xué)分型方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)等位基因組特異性引物（PCRSSP）[5]、多聚酶鏈反應(yīng)序列特異寡核苷酸探針（PCRSSOP）[6]、聚合酶反應(yīng)直接測(cè)序法（PCRSBT）[7]。前兩種方法屬于低分辨HLA分型方法，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性；PCRSBT可以直接對(duì)HLA基因型的序列進(jìn)行測(cè)定，分辨率高，能直接發(fā)現(xiàn)新的等位基因，但是由于雜合子的存在，需將同源染色體分離后才能得到各個(gè)單元型的準(zhǔn)確結(jié)果，增加了操作的復(fù)雜性，檢測(cè)成本也相應(yīng)增高[8]。

2013年，Tohkin等[9]對(duì)日本14個(gè)別嘌呤醇誘發(fā)的SJS/TEN過敏人和991個(gè)正常健康人的全基因組關(guān)聯(lián)研究分析表明，位于6號(hào)染色體的銀屑病易感基因1候選基因1（Psoriasis Susceptibility1 Candidate1，PSORS1C1）上的rs9263726位點(diǎn)，存在G>A的多態(tài)性改變，該位點(diǎn)突變型A與HLAB*58∶01存在完全的等位基因關(guān)聯(lián)。因此，如能證實(shí)中國(guó)漢族人群存在同樣的等位基因關(guān)聯(lián)，采用rs9263726位點(diǎn)代替HLA基因直接測(cè)序，進(jìn)行別嘌呤醇用藥前HLAB*58∶01高致敏基因型的篩查，可以有效降低SJS/TEN致死性皮膚性過敏發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)并節(jié)約成本。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、無(wú)需熒光標(biāo)記等技術(shù)優(yōu)勢(shì)[10～12]，本研究選用焦磷酸測(cè)序技術(shù)建立了rs9263726位點(diǎn)的多態(tài)性分析方法。隨機(jī)選擇了683例庫(kù)存核酸標(biāo)本，進(jìn)行了rs9263726位點(diǎn)多態(tài)性分型，首次得到中國(guó)人群該位點(diǎn)的基因頻率。同時(shí)，對(duì)46例標(biāo)本進(jìn)行了HLAB基因的PCRSBT直接測(cè)序和rs9263726位點(diǎn)多態(tài)性分析，對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行了比較。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Q24焦磷酸測(cè)序儀（德國(guó)Qiagen公司）；A200基因擴(kuò)增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；微量紫外分光光度計(jì)（南京伍義科技有限公司）；VORTEXGENIE 2渦漩混勻器（美國(guó)Scientific Industries基因公司）；Legand Micro 21R冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司），BG200恒溫混勻儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）。

PCR擴(kuò)增體系試劑盒（日本Takara公司）；全血基因組提取試劑盒（美國(guó)Promega公司）；焦磷酸測(cè)序試劑盒及退火和結(jié)合緩沖液（德國(guó)Qiagen公司）；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為滅菌蒸餾水。

所有引物由上海Invitrogen公司合成，具體引物名稱及序列見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 改進(jìn)的基因組DNA提取方法 本研究采用經(jīng)過改進(jìn)的Wizard Genomic DNA Purification Kit提取法，提取基因組核酸，具體步驟如下：首先將175 μL抗凝全血和450 μL Cell Lysis Solution 混合，室溫放置6 min，13000 g離心20 s，棄上清液，保留底部沉淀和約20 μL上清液，渦旋至底部沉淀均勻分散至上清液中；加入180 μL Nuclei Lysis溶液，用移液器吹打混合均勻，36 ℃孵育5 min；降至室溫后加入70 μL Protein Precipitation溶液，渦旋振蕩30 s，13000 g離心5 min；上清液轉(zhuǎn)管至300 μL異丙醇中，沉淀核酸，13000 g離心1 min；棄上清液后加入200 μL 70%乙醇洗滌沉淀，除去乙醇后晾干沉淀，加入80 μL DNA Rehydration Solution即得到基因組DNA溶液。

2.2.3 焦磷酸測(cè)序引物設(shè)計(jì) 擴(kuò)增引物使用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，測(cè)序引物使用Qiagen公司的Assay Design Software 2.0軟件設(shè)計(jì)。

2.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系體積為50 μL，包括dNTP 200 μmol/L，10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，Taq酶1.25 U，上下游引物0.4 μmol/L，基因組DNA 2.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。

2.2.5 焦磷酸測(cè)序 取20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2 μL親和素修飾的微球，與18 μL蒸餾水、40 μL結(jié)合緩沖液混合，振蕩孵育7 min，使用單鏈制備模塊制備測(cè)序需要的單鏈，加入含有10 μmol/L測(cè)序引物和24 μL退火緩沖液的24孔板中，85 ℃解鏈1 min，室溫退火，放入焦磷酸測(cè)序儀中固定。設(shè)置測(cè)序推注順序?yàn)椤癈AAGGT”，其中“C”為rs9263726位點(diǎn)前的一個(gè)參比堿基，同理堿基“T”為其后的參比堿基，第一個(gè)“A”為rs9263726位點(diǎn)的突變型信號(hào)峰，第二個(gè)“A”可獲知A堿基的測(cè)序本底，同理G堿基為野生型信號(hào)峰。在焦磷酸測(cè)序儀的試劑倉(cāng)中依次加入4種堿基A、C、G、T，測(cè)序底物（S）和酶（E），運(yùn)行程序10 min后得到相應(yīng)測(cè)序圖譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 改進(jìn)的基因組DNA提取方法

通過降低抗凝全血用量、縮短離心和孵育時(shí)間等步驟，對(duì)Wizard Genomic DNA Purification Kit法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后僅需175 μL DETA抗凝全血就可以得到大于3 μg的基因組核酸，所需血量比原有方法減少了40%，提取時(shí)間減少了30%。得到基因組DNA濃度范圍在50～100 ng/μL，A260/A280為1.8～2.0，能滿足后續(xù)焦磷酸測(cè)序的需要。

3.2 基因組DNA樣本濃度對(duì)焦磷酸測(cè)序檢測(cè)rs9263726位點(diǎn)的影響

設(shè)置3個(gè)濃度分別為10.0，2.0和0.4 ng/μL以及空白的人基因組DNA樣品，考察建立的rs9263726位點(diǎn)測(cè)序方法，選擇A260/A280比值在1.8～2.0之間、初始濃度約為50 ng/μL的人基因組DNA用蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋。每個(gè)梯度平行擴(kuò)增3管，以焦磷酸測(cè)序是否獲得預(yù)期的信號(hào)峰來(lái)評(píng)判本方法中基因組DNA濃度對(duì)rs9263726位點(diǎn)的影響，結(jié)果如圖1所示，圖中灰色區(qū)域?yàn)镾NP的判別區(qū)域，第一個(gè)“A”出現(xiàn)信號(hào)峰代表突變型信號(hào)，“G”出現(xiàn)信號(hào)峰代表野生型信號(hào)，可見本方法可檢測(cè)濃度低至0.4 ng/μL的人基因組DNA模板樣品。

3.3 焦磷酸測(cè)序檢測(cè)rs9263726位點(diǎn)的準(zhǔn)確率

選擇20例庫(kù)存人基因組DNA標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本平行擴(kuò)增2份，一份用焦磷酸測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)，一份用Sanger測(cè)序方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2，焦磷酸測(cè)序方法對(duì)rs9263726位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確率為100%。

3.4 rs9263726位點(diǎn)在中國(guó)人群中基因分布頻率

目前，還未見中國(guó)人群中rs9263726位點(diǎn)基因分布頻率的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此研究該位點(diǎn)在中國(guó)人群中的分布頻率十分必要。本研究選擇2013年7月～2014年7月期間本實(shí)驗(yàn)室核酸標(biāo)本庫(kù)中的683例人基因組核酸標(biāo)本，進(jìn)行rs9263726位點(diǎn)的測(cè)序分析，683例標(biāo)本檢出野生純合型（GG型）標(biāo)本598例，突變雜合型（GA型）標(biāo)本80例，突變純合型（AA型）標(biāo)本5例。上述結(jié)果表明，rs9263726位點(diǎn)野生型分布頻率為87.6%，突變雜合型分布頻率為11.7%，突變純合型分布頻率為0.7%，突變型的總分布頻率為12.4%。

3.5 rs9263726位點(diǎn)表征HLAB*58∶01基因型的特異性評(píng)價(jià)

雖然日本的研究者已經(jīng)評(píng)價(jià)了日本人群中rs9263726位點(diǎn)與HLAB*58∶01基因型存在完全的等位基因關(guān)聯(lián)，但是還未見表征該位點(diǎn)在中國(guó)人群中是否也具有類似的關(guān)聯(lián)關(guān)系的報(bào)道，所以本研究隨機(jī)選擇了21例rs9263726位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為野生型、25例檢測(cè)結(jié)果為突變型的標(biāo)本送華大基因采用PCRSBT的方法進(jìn)行HLAB分型。46例隨機(jī)選擇的標(biāo)本驗(yàn)證結(jié)果表明，rs9263726位點(diǎn)表征HLAB*58∶01基因型的靈敏度（采用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)rs9263726位點(diǎn)正確判定檢測(cè)標(biāo)本含有HLAB*58∶01基因型的比例）達(dá)到100%，特異性（采用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)rs9263726位點(diǎn)正確判定檢測(cè)標(biāo)本不含有HLAB*58∶01基因型的比例）為91.3%。

4 結(jié) 論

rs9263726位點(diǎn)存在G>A的多態(tài)性改變，本研究結(jié)果表明，在中國(guó)人群中該位點(diǎn)突變型A與HLAB*58∶01基因型存在緊密的連鎖關(guān)系，通過采用焦磷酸測(cè)序方法測(cè)定rs9263726位點(diǎn)的基因型，可以間接確定被檢測(cè)對(duì)象是否攜帶有HLAB*58∶01基因型，與直接采用PCRSBT法對(duì)HLAB進(jìn)行分型相比，可有效降低檢測(cè)成本，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，且無(wú)需專業(yè)的分型軟件[11]。本研究表明，rs9263726位點(diǎn)對(duì)HLAB*58∶01基因型的檢出靈敏度高達(dá)100%，特異性也達(dá)到了91.3%。這與文獻(xiàn)[13]采用ILLumina公司的芯片對(duì)rs9262570位點(diǎn)檢測(cè)HLAB*58∶01基因型得到的結(jié)果相近。Cao等[14]對(duì)572例中國(guó)漢族人的研究結(jié)果表明，HLAB*58∶01基因型分布頻率為13.99%，這與本研究中rs9263726位點(diǎn)突變型的分布頻率12.4%非常接近。

采用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)rs9263726位點(diǎn)的基因型代替現(xiàn)有PCRSBT法對(duì)HLAB*58∶01的檢測(cè)可節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，降低患者就醫(yī)成本，避免由于攜帶HLAB*58∶01基因型而引發(fā)的高致死性SJS/TEN綜合征的發(fā)生，具有非常廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Abstract A new method for polymorphism detection of rs9263726 site on Psoriasis Susceptibility1 Candidate1（PSORS1C1） was established based on the pyrosequencing technology and the improved method of genomic DNA extraction from whole blood. The detection limit of the method was 0.4 ng/μL genomic DNA. A total of 20 samples were detected by pyrosequencing， and the results were consistent with those of Sanger sequencing. A total of 683 clinical samples were analyzed with pyrosequencing method. The polymorphism distribution of rs9263726 in Chinese populations was summarized as GG （87.6%）， GA （11.7%） and AA （0.7%）. 46 clinical samples were detected to analyze the relationship between rs9263726 genotype and human leukocyte antigen gene HLAB*58∶01 genotype. The results showed that the genotype of HLAB*58∶01 could be predicted by polymorphism detection of rs9263726 site sequence. The sensitivity of the proposed method was 100%， and the specificity was 91.3%. This study demonstrated a new method for HLAB*58∶01 genotyping.

Keywords Human leukocyte antigen gene HLAB*58∶01； Pyrosequencing； Rs9263726 site； Genotype