李寶新，張云良，王君，周雪，梁璇璇，常文龍，郭淑芹

· 論著 ·

糖尿病合并高血壓大鼠瘦素和神經(jīng)肽Y水平變化

李寶新1，張云良1，王君1，周雪1，梁璇璇1，常文龍1，郭淑芹1

目的 探討糖尿病合并高血壓大鼠血清、下丘腦神經(jīng)肽Y（NPY）和瘦素水平變化。方法 30只SD大鼠隨機分為對照組、糖尿病組、糖尿病合并高血壓組，分別制作2型糖尿病模型和糖尿病合并高血壓模型，各剔除1只。測定空腹血糖水平、血清NPY和瘦素水平，免疫組織化學(xué)法測定下丘腦瘦素和NPY表達情況。結(jié)果 與對照組比較，糖尿病組及糖尿病合并高血壓組空腹血糖、瘦素和NPY水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。糖尿病合并高血壓組瘦素和NPY水平高于糖尿病組和對照組，數(shù)值為［（0.73±0.24）μg/L vs. （0.46±0.14）μg/L］、［（0.73±0.24）μg/L vs. （0.24±0.05）μg/L］，［（300.53 ±35.74）ng/L vs. （247.46±40.36）ng/L］、［（300.53±35.74）ng/L vs. （133.52±16.58）ng/L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。糖尿病組及糖尿病合并高血壓組的瘦素和NPY表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。同時，糖尿病合并高血壓組的下丘腦瘦素和NPY水平均高于糖尿病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。糖尿病合并高血壓組大鼠的血清瘦素和NPY水平呈正相關(guān)（r=0.952，P＜0.05）、下丘腦瘦素和NPY表達水平呈正相關(guān)（r=0.956，P＜0.05）。結(jié)論 糖尿病合并高血壓大鼠血清、下丘腦瘦素和神經(jīng)肽水平升高，代謝紊亂加重。

高血壓；糖尿??；大鼠；神經(jīng)肽Y；瘦素

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，并發(fā)癥多、預(yù)后差，目前缺乏完全治愈的方法。瘦素是由脂肪細胞合成和分泌，是一種能量平衡調(diào)節(jié)激素，可抑制食欲。下丘腦神經(jīng)肽Y（NPY）經(jīng)下丘腦弓狀核分泌，是一種強烈的食欲刺激因子，參與攝食行為和能量消耗。研究顯示，瘦素和NPY在2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用［1］。糖尿病引起高血壓，而高血壓又可加重糖尿病，二者相互影響。本研究旨在探討糖尿病合并高血壓大鼠血清、下丘腦NPY和瘦素的表達變化，以期了解代謝紊亂的相關(guān)機制。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器 鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司，瘦素和NPY檢測試劑盒購自河北博海生物工程開發(fā)公司，瘦素和NPY抗體購自北京中杉金橋公司。主要儀器：德國羅氏全自動化學(xué)發(fā)光分析儀，日本日立全自動生化分析儀，德國LEICA公司石蠟切片機等。

1.2動物分組及制模 雄性SD大鼠30只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SPF級，合格證號11400700150970，體重180～220 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。隨機分為3組：對照組、糖尿病組、糖尿病合并高血壓組，每組各10只。2型糖尿病大鼠模型制備：給予高糖高脂飼料（普通飼料中加入20%蔗糖、15%熟豬油、2.5%膽固醇）8周，禁食12 h后腹腔注射STZ（0.1 mmol/L檸檬酸鈉溶液配制，PH4.2），劑量為30 mg/kg。于實驗第9周末選取尾靜脈空腹血糖≥7.8 mmol/L，且伴有胰島素抵抗者作為糖尿病動物模型［2］。糖尿病合并高血壓大鼠模型制備：在糖尿病模型制備成功1周后，分離大鼠左腎動脈，將動脈縮窄30%～50%，2周后測量血壓＞160 mmHg的作為糖尿病合并高血壓大鼠模型［3］。對照組無任何干預(yù)措施。糖尿病組、糖尿病合并高血壓組各有1只造模失敗。

1.3瘦素和NPY水平測定 糖尿病、糖尿病合并高血壓大鼠模型制備成功后，三組大鼠均空腹注射4%的水合氯醛麻醉，常規(guī)方法開腹，取腹主動脈血5 ml，經(jīng)3000 r/min離心20 min，取上清液。采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖水平。采用放射免疫法應(yīng)用瘦素和NPY檢測試劑盒測定其水平。

1.4下丘腦NPY和瘦素的表達測定 ①標(biāo)本制作：以0.9%生理鹽水經(jīng)心臟血管灌洗全腦，斷頭取腦，取下丘腦。經(jīng)4%甲醛固定48 h后將組織修塊，采用石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，室溫放置30 min；②切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；③將組織切片浸泡于PH6.0的PBS緩沖液中，采用微波修復(fù)抗原30 min；④3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；⑤加入抗體：Leptin兔多克隆抗體（1：200）、NPY兔多克隆抗體（1：250），4℃過夜后復(fù)溫39 min，PBS沖洗3次，2 min/次；后加入生物素標(biāo)記二抗（1：200），室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，2 min/次；⑥滴加SABC工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，2 min/次；⑦采用蘇木素復(fù)染，后水洗5 min；⑧脫水晾干，透明樹膠封片。結(jié)果判定：以胞質(zhì)及胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。免疫組織化學(xué)評分（HIS）參照文獻［4］方法，應(yīng)用IPP多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)，每例標(biāo)本在顯微鏡下隨機選取5個高倍視野（× 400），結(jié)合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面進行評分：a為陽性細胞百分比（無陽性細胞計0分，陽性細胞占1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，81%～100%計4分）；b為陽性細胞染色強弱（陰性計0分，弱陽性計1分，中度陽性計2分，強陽性計3分），a、b兩項乘積即為IHS評分。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用方差分析。相關(guān)性檢驗采取Person相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組大鼠空腹血糖、瘦素和NPY水平比較 與對照組比較，糖尿病組及糖尿病合并高血壓組空腹血糖、瘦素和NPY水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。糖尿病合并高血壓組瘦素和NPY水平高于糖尿病組和對照組的數(shù)值為［（0.73 ±0.24）μg/L vs. （0.46±0.14）μg/L］、［（0.73± 0.24）μg/L vs. （0.24±0.05）μg/L］，［（300.53± 35.74）ng/L vs. （247.46±40.36）ng/L］、［（300.53 ±35.74）ng/L vs. （133.52±16.58）ng/L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2三組大鼠下丘腦瘦素和NPY表達比較 糖尿病組及糖尿病合并高血壓組的瘦素和NPY表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。同時，糖尿病合并高血壓組的下丘腦瘦素和NPY水平均高于糖尿病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表2、圖1、圖2）。

2.3糖尿病合并高血壓大鼠瘦素與NPY的相關(guān)性分析 糖尿病合并高血壓組大鼠的血清瘦素和NPY水平呈正相關(guān)（r=0.952，P＜0.05）、下丘腦瘦素和NPY表達水平呈正相關(guān)（r=0.956，P＜0.05）。

3　討論

表1　三組大鼠空腹血糖、瘦素和NPY水平比較

近年來，我國的糖尿病發(fā)病率逐漸升高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢。糖尿病患者常伴水、蛋白質(zhì)及脂肪代謝紊亂，是高血壓發(fā)病的重要危險因素。糖尿病合并高血壓的患者心肌梗死、腦卒中的發(fā)病幾率比正常人高4～8倍。脂肪細胞對能量代謝有重要調(diào)節(jié)作用，其分泌的激素和生物活性因子在糖尿病、高血壓的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要的角色，如瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子等。

表2　三組大鼠下丘腦瘦素和NPY的表達水平比較（分）

圖1　三組大鼠下丘腦瘦素的表達情況（×400；免疫組化；A：對照組；B：糖尿病組；C：糖尿病合并高血壓組）

圖2　三組大鼠下丘腦NPY的表達情況（×400；免疫組化；A：對照組；B：糖尿病組；C：糖尿病合并高血壓組

瘦素是一種脂肪細胞分泌的脂源性內(nèi)分泌多肽激素，參與調(diào)控機體攝食、體溫、能量平衡，與胰島素之間存在雙向調(diào)節(jié)［5］。正常情況下，瘦素調(diào)節(jié)攝食行為和能量平衡。病理情況下，機體出現(xiàn)瘦素抵抗，瘦素對胰島素的抑制作用減弱，攝食量增加，血糖水平升高。研究顯示［6］，瘦素的異常分泌是2型糖尿病發(fā)病的前兆。而且瘦素參與機體能量的調(diào)節(jié)可能是通過下丘腦NPY實現(xiàn)的。NPY是由下丘腦弓狀核神經(jīng)元合成和分泌，是一種很強的食欲刺激因子，在神經(jīng)內(nèi)分泌中起神經(jīng)調(diào)質(zhì)作用［7］。正常情況下，NPY升高一方面增加食欲，另一方面增加體內(nèi)脂肪含量，使體重增加。瘦素可與NPY神經(jīng)元上的瘦素受體結(jié)合，抑制NPY分泌，二者形成瘦素-下丘腦NPY軸，參與攝食，影響糖脂代謝［8］。當(dāng)垂體受損時，瘦素和NPY出現(xiàn)轉(zhuǎn)運障礙，從而出現(xiàn)碳水化合物代謝異常［9］。糖尿病的發(fā)病可能與NPY和瘦素有關(guān)，但血壓對糖尿病NPY和瘦素的影響目前未見報道。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病合并高血壓大鼠血清瘦素和NPY水平、下丘腦瘦素和NPY蛋白表達水平均高于糖尿病組，說明高血壓改變了原有糖尿病瘦素和NPY的水平。有動物實驗發(fā)現(xiàn)［10］，瘦素是自發(fā)性高血壓大鼠的血管平滑肌細胞的增殖因子，增加血管阻力，可導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生。糖尿病合并高血壓大鼠胰島素抵抗進一步加重，加重病情。其可能的機制是瘦素的下游信號出現(xiàn)障礙，抑制了NPY神經(jīng)元，導(dǎo)致下丘腦NPY水平上調(diào)?？傊喜⒏哐獕嚎稍黾犹悄虿〈笫蟮氖菟睾蚇PY水平，加重代謝紊亂，瘦素和NPY兩者之間呈正相關(guān)，這為防治糖尿病患者出現(xiàn)高血壓提供了依據(jù)。

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本文編輯：姚雪莉

Changes of Neuropeptide Y （NPY） and leptin in rats with diabetes complicated with hypertension

LI Bao-xin*， ZHANG Yun-liang， WANG Jun， ZHOU Xue， LIANG Xuan-xuan， CHANG Wen-long， GUO Shu-qin.*Department of Endocrinology， First Central Hospital of Baoding City， Baoding 071000， China.

GUO Shu-qin， E-mail： nfmgsq@sina.com

Objective To discuss the changes of serum and hypothalamus Neuropeptide Y （NPY） and leptin in rats with diabetes complicated with hypertension. Methods SD rats （n=30） were randomly divided into control group， diabetes group and diabetes+hypertension group， and model of type 2 diabetes mellitus and model of diabetes+hypertension were established. The levels of fasting plasma glucose， serum NPY were detected，and expressions of hypothalamus leptin and NPY were detected by using immunohistochemistry technique. Results Compared with control group， the levels of FPG， leptin and NPY increased in diabetes group and diabetes+hypertension group （all P＜0.05）. The levels of leptin and NPY were higher in diabetes+hypertension group than those in diabetes group and control group ［（0.73±0.24） μg/L vs. （0.46±0.14） μg/L］， ［（0.73±0.24） μg/L vs.（0.24±0.05） μg/L］， ［（300.53±35.74） ng/L vs. （247.46±40.36） ng/L］， ［（300.53±35.74） ng/L vs. （133.52±16.58）ng/L， all P＜0.05］. The expressions of leptin and NPY were higher in diabetes group and diabetes+hypertension group than those in control group （all P＜0.05）. At the same time， the levels of hypothalamus leptin and NPY were higher in diabetes+hypertension group than those in diabetes group （all P＜0.05）. The level of serum leptin was positively correlated to level of serum NPY （r=0.952， P＜0.05）， and expression of hypothalamus leptin was positively correlated to expression of hypothalamus NPY （r=0.956， P＜0.05） in diabetes+hypertension group. Conclusion The levels of serum and hypothalamus leptin and NPY increase and metabolic disorder is severer in rats with diabetes complicated with hypertension.

Hypertension； Diabetes； Rats； Neuropeptide Y； Leptin

R544.1

A

1674-4055（2016）09-1040-03

國家自然科學(xué)基金面上項目（81500644）

1071000 保定，保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

郭淑芹，E-mail：nfmgsq@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.09.05