張弦，蔣偉，甘建和，蔣道榮

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2南通大學(xué)；3蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

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恩替卡韋治療慢性乙型肝炎的療效及其對外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平的影響

張弦1，蔣偉2，甘建和3，蔣道榮1

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2南通大學(xué)；3蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目的 觀察恩替卡韋治療慢性乙型肝炎(CHB)的效果及其對患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)、CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg)水平的影響。方法 選擇CHB患者48例(CHB組)、體檢健康者22例(對照組)，CHB組給予恩替卡韋治療48周；CHB組治療前后取外周血，全自動生化分析儀測定血清ALT、AST，化學(xué)發(fā)光分析儀檢測HBsAg、HBeAg，采用RT-PCR法檢測HBV DNA，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Treg、Treg；取對照組外周血，僅檢測CD4+CD25+Treg、Treg。分析Treg與CD4+CD25+Treg、HBV DNA、ALT、AST的關(guān)系。結(jié)果 CHB組治療后血清ALT、AST、HBeAg、HBV DNA均低于治療前(P均<0.01)，HBsAg治療前后未見顯著性差異(P>0.05)。CHB組治療前外周血CD4+CD25+Treg和Treg均高于對照組(P均<0.05)，CHB組治療后外周血CD4+CD25+Treg和Treg均低于治療前(P均<0.05)。恩替卡韋治療前后，CHB組外周血Treg與CD4+CD25+Treg均呈正相關(guān)(r=0.80、0.75,P均<0.05)，與血清ALT、AST均呈正相關(guān)(r分別為0.67、0.70及0.57、0.62，P均<0.01)，與血清HBV DNA呈正相關(guān)(r=0.331、0.345，P均<0.01)，與HBsAg、HBeAg均無關(guān)(r分別為0.24、0.19及0.15、0.33，P均﹥0.05)。結(jié)論 CHB患者外周血CD4+CD25+Treg、Treg水平升高；恩替卡韋能明顯降低CHB患者外周血CD4+CD25+Treg、Treg水平，從而降低HBV DNA、改善肝功能。

慢性乙型肝炎；恩替卡韋；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；乙型肝炎病毒；肝功能

據(jù)WHO統(tǒng)計，全球約20億人曾感染過乙型肝炎病毒(HBV)，其中3.5億人為慢性HBV感染者；我國現(xiàn)有慢性HBV感染者約9 300萬人，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者約2 000萬[1,2]。HBV的持續(xù)存在和復(fù)制導(dǎo)致肝炎反復(fù)發(fā)作，甚至進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌。CHB患者機(jī)體存在免疫功能紊亂，其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)具有免疫抑制功能，可促進(jìn)HBV持續(xù)感染，與HBV感染慢性化及肝病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[3]。但CD25分子在其他T細(xì)胞中也有表達(dá)，不能作為Treg的特異性標(biāo)志。叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(FOXP3)主要表達(dá)在CD4+CD25+Treg上，與 Treg的功能密切相關(guān)。目前認(rèn)為，F(xiàn)OXP3不僅是調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg發(fā)育的一個重要開關(guān)，而且對于CD4+CD25+Treg的生長發(fā)育和功能維持起著重要作用。因此，F(xiàn)OXP3是目前定義CD4+CD25+Treg的最佳標(biāo)志物[4]。目前抗HBV治療已經(jīng)取得了很好的療效，近15年來核苷(酸)類似物有顯著的發(fā)展和演化，當(dāng)前國際指南推薦使用有效的恩替卡韋作為CHB抗病毒治療的第一線藥物[5]。恩替卡韋對HBV有抑制作用，可使患者獲得病毒學(xué)、生化指標(biāo)和組織學(xué)等方面的改善[6]，但恩替卡韋對CHB患者CD4+CD25+Treg、Treg的調(diào)節(jié)作用及臨床意義國內(nèi)外報道較少。2013年7月～2015年12月，我們觀察了恩替卡韋治療CHB患者的效果，檢測了治療前后患者外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)水平變化，并分析治療前后Treg與ALT、AST、HBV DNA的相關(guān)性，進(jìn)一步明確恩替卡韋的免疫調(diào)節(jié)作用，為評估其免疫治療及抗病毒療效提供新的參考。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院感染性疾病科門診和住院CHB 患者48例(CHB組)，男36例、女12例，年齡18～60(43.64±9.35)歲，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》[2]。其中CHB輕度15例，中度20例，重度13例；患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒的重疊感染及自身免疫、藥物等其他原因所致的肝損傷。同時選取20例健康體檢者為對照組，男13例、女7例，年齡22～55(40.21±11.38)歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，均簽署知情同意書。兩組間性別、年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2治療方法CHB組給予恩替卡韋0.5 mg(蘇州東瑞制藥有限公司)，1次/d，連用48周。患者均未接受免疫調(diào)節(jié)和抗病毒治療。

1.3觀察指標(biāo)與檢測方法CHB組治療前后取清晨空腹外周血4 mL，其中常規(guī)促凝管3 mL，分離血清后檢測ALT、AST、HBsAg、HBeAg、HBV DNA判斷療效；EDTA抗凝血1 mL，用于CD4+CD25+Treg、Treg檢測(24 h內(nèi)完成)。對照組取清晨空腹外周血4 mL，僅用于CD4+CD25+Treg、Treg檢測(24 h內(nèi)完成)。采用HTIACHI7170A全自動生化分析儀檢測ALT、AST，ELISA-ELM3000酶標(biāo)分析儀檢測 HBV血清標(biāo)志物HBsAg及HBeAg，Roche LightCycler熒光定量PCR分析儀檢測HBV DNA。外周血CD4+CD25+Treg、Treg檢測：吸取100 μL EDTA抗凝全血，以淋巴細(xì)胞分離液處理，獲取外周血單核細(xì)胞(PBMC)。分別加入10 μL FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體和Per-CP標(biāo)記的抗人CD25抗體，室溫避光孵育20 min；加溶血素2 mL，室溫避光放置10 min；250 r/min離心10 min，去上清，重懸于2 mL PBS中；室溫250 g×10 min離心，去上清；再加入10 μL PE標(biāo)記的抗人FOXP3抗體，漩渦震蕩，重懸于2 mL PBS中；室溫500 r/min離心5 min，去上清，重復(fù)1次，去上清后重懸于300 μL PBS中；應(yīng)用 FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)計數(shù)CD4+CD25+Treg、Treg，并計算其占淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，以此表示CD4+CD25+Treg、Treg水平。

2　結(jié)果

2.1恩替卡韋治療CHB的療效經(jīng)恩替卡韋治療48周后，CHB患者血清ALT、AST、HBeAg、HBV DNA均明顯低于治療前(P均<0.01)，HBsAg治療前后水平未見顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1　恩替卡韋治療前后CHB患者血清ALT、AST、HBsAg、HBeAg、HBV DNA比較

注：與治療前比較，*P<0.01。

2.2兩組外周血CD4+CD25+Treg、Treg水平比較CHB組治療前CD4+CD25+Treg和Treg水平均明顯高于對照組(P均<0.05)；CHB組經(jīng)恩替卡韋治療48周后CD4+CD25+Treg和Treg水平均明顯低于治療前(P均<0.05)。見表2。

表2　　　　兩組外周血CD4+CD25+ Treg、Treg水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05。

2.3 恩替卡韋治療前后CHB患者Treg與CD4+CD25+Treg及各臨床指標(biāo)的關(guān)系恩替卡韋治療前，CHB患者外周血Treg與CD4+CD25+Treg呈正相關(guān)(r=0.80,P<0.05)，與血清ALT、AST 均呈正相關(guān)(r=0.67、0.70，P均<0.01)，與血清HBV DNA呈正相關(guān)(r=0.331，P<0.01)。與HBsAg、HBeAg均無關(guān)(r=0.24、0.19，P均>0.05)。恩替卡韋治療后，CHB患者外周血Treg 與CD4+CD25+Treg呈正相關(guān)(r=0.75，P<0.05)，與血清 ALT、AST 水平均呈正相關(guān)(r=0.57、0.62，P均<0.01)，與血清 HBV DNA 呈正相關(guān)(r=0.345，P<0.01)。與HBsAg、HBeAg均無關(guān)(r=0.15、0.33，P均>0.05)。

3　討論

HBV慢性感染是一個全球性公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害人民的身體健康?？笻BV是治療CHB 的關(guān)鍵。恩替卡韋為鳥嘌呤核苷類似物，是一種新的抗病毒藥物，對HBV多聚酶具有抑制作用，具有高效性及良好的耐受性。恩替卡韋能夠通過磷酸化成為具有活性的恩替卡韋三磷酸鹽，然后與HBV多聚酶的天然底物三磷酸脫氧鳥嘌呤核苷競爭，抑制病毒多聚酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)的3種活性，即通過抑制HBV多聚酶的啟動、前基因組mRNA 逆轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈的形成以及HBV DNA正鏈的合成，從而選擇性抑制HBV的復(fù)制[7，8]。

臨床評價抗HBV療效的指標(biāo)主要包括患者血清HBV DNA、ALT、AST水平和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換及患者的免疫應(yīng)答反應(yīng)狀態(tài)。因此，HBV能否被徹底地清除，不僅依賴有效的抗病毒治療，還依賴機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)。CD4+CD25+Treg是目前所發(fā)現(xiàn)最重要的專職免疫抑制性調(diào)節(jié)細(xì)胞，在病原體的慢性持續(xù)性感染過程中，發(fā)揮維持免疫耐受的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg與HBV感染的慢性化有關(guān)。CD4+CD25+Treg的數(shù)量和功能異常，可使病毒性肝炎在體內(nèi)慢性遷延以及產(chǎn)生免疫耐受。目前多項研究表明，CD4+CD25+Treg能特異性表達(dá)FOXP3，F(xiàn)OXP3對此類細(xì)胞的發(fā)育和功能的誘導(dǎo)起關(guān)鍵作用,是鑒定CD4+CD25+Treg的一個特異性標(biāo)物[9，10]。CHB患者CD4+CD25+Treg水平升高，但由于CD25是IL-2受體的α鏈，同時可見于激活的T細(xì)胞上，故CD4+CD25+Treg也包含有部分活化的CD4+T細(xì)胞，作為判斷CD4+CD25+Treg的表型欠妥。故在本研究中，在檢測Treg的同時也檢測了CD4+CD25+Treg，兩者結(jié)合有助于更準(zhǔn)確地識別有免疫抑制作用的Treg。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血Treg及CD4+CD25+Treg水平均較對照組有顯著升高(P均<0.05)，且兩者呈線性正相關(guān)，反映了真正意義上的Treg而非短暫活化的CD4+CD25+Treg，證實了CHB患者體內(nèi)增高的主要是那部分有調(diào)節(jié)意義的天然性Treg細(xì)胞，與Stoop等的研究結(jié)果一致[11]。本研究采用恩替卡韋治療CHB患者48周后，外周血CD4+CD25+Treg和Treg水平均明顯低于治療前 (P均<0.05)。結(jié)果提示，恩替卡韋對CHB患者的免疫調(diào)節(jié)活性可能與Treg水平下調(diào)有關(guān)。

Peng等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血CD4+CD25+Treg數(shù)量高于健康人，且慢性HBV感染患者CD4+CD25+Treg的增加與HBV DNA呈正相關(guān)。CD4+CD25+Treg可以通過誘導(dǎo)和維持機(jī)體免疫耐受使CHB患者體內(nèi)病毒難以完全清除，病程慢性化[13]。本研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血Treg與HBV DNA 均明顯升高，且二者之間呈正相關(guān)。CHB患者持續(xù)感染的原因可能是體內(nèi)Treg數(shù)量或功能異常，降低了機(jī)體對HBV特異性的效應(yīng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的應(yīng)答，使HBV不能被徹底清除，形成一種免疫耐受狀態(tài)，導(dǎo)致HBV感染持續(xù)并慢性化。經(jīng)恩替卡韋治療后，CHB患者外周血Treg與HBV DNA均較治療前明顯下降。提示Treg下降能夠增強機(jī)體特異性清除HBV的反應(yīng)，恩替卡韋可能通過免疫調(diào)節(jié)起到抑制病毒的作用。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)恩替卡韋治療后，反映CHB病情的生化指標(biāo)如ALT、AST和血清學(xué)指標(biāo)HBeAg均比治療前明顯降低。因此，恩替卡韋對CHB具有明顯的治療效果，根據(jù)本研究結(jié)果和Treg的功能，恩替卡韋通過降低CHB患者體內(nèi)的Treg，減弱機(jī)體對HBV免疫耐受的強度或打破了機(jī)體對HBV形成的免疫耐受，從而清除了HBV，降低ALT、AST及HBeAg水平，有效地治療CHB。

韓捷等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者體內(nèi)CD4+CD25+Treg比例高于正常，且與ALT呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB組恩替卡韋治療前后外周血Treg與患者治療前后血清ALT、AST水平均呈正相關(guān)，表明恩替卡韋治療前后外周血中Treg與病毒復(fù)制情況及患者的肝功能密切相關(guān)。恩替卡韋通過降低Treg清除HBV，降低ALT、AST水平，有效地改善或恢復(fù)了正常肝功能。因此，恩替卡韋可通過影響免疫學(xué)因素(調(diào)節(jié)Treg)對CHB患者發(fā)揮重要的治療作用。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.016

R512

B

1002-266X(2016)34-0042-03

江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(YB2015177)。

蔣道榮(E-mail: jdr@ntu.edu.cn)

2016-03-29)