王蘭芳，林娟，王小敏

(1海口巿中醫(yī)院,海口570203；2海南省中醫(yī)院)

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胃癌組織中節(jié)律基因Period1和Period2的表達(dá)變化及意義

王蘭芳1，林娟2，王小敏1

(1?？趲堉嗅t(yī)院,海口570203；2海南省中醫(yī)院)

目的觀察節(jié)律基因Period1和Period2在胃癌組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 選擇138例胃癌患者，術(shù)中留取胃癌及癌旁組織，采用免疫組化法檢測(cè)胃癌及癌旁組織中的Period1和Period2，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)胃癌及癌旁組織中的Period1和Period2 mRNA。結(jié)果胃癌組織中Period1和Period2陽(yáng)性表達(dá)率分別為23.2%、31.2%，均低于癌旁組織中的44.9%、64.5%(P均<0.01)；胃癌組織中Period1 mRNA和Period2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.05±0.10、1.09±0.12，均低于癌旁組織中的1.31±0.13、1.47±0.16(P均<0.01)；Period1 mRNA表達(dá)與胃癌組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Lauren分型有關(guān)(P均<0.05)，Period2 mRNA表達(dá)與胃癌組織分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Lauren分型均有關(guān)(P均<0.05)；相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中Period1與Period2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.285，P<0.05)，Period1 mRNA與Period2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.379，P<0.05)。結(jié)論 胃癌組織中節(jié)律基因Period1和Period2呈低表達(dá)，可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

胃癌；節(jié)律基因；Period1；Period2

胃癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤，患者早期多無明顯癥狀或癥狀輕微，易錯(cuò)過最佳的治療時(shí)機(jī)，多數(shù)患者臨床確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后不佳[1]。因此，早期發(fā)現(xiàn)胃癌患者對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。研究表明[2]，胃癌發(fā)生及進(jìn)展過程涉及多種癌基因和抑癌基因的相互作用及由此而導(dǎo)致的一系列細(xì)胞生物學(xué)行為變化。研究發(fā)現(xiàn)[3]，生物鐘節(jié)律在維持正常生物節(jié)律及細(xì)胞增殖、凋亡周期中發(fā)揮重要作用。生物節(jié)律一旦發(fā)生改變，可導(dǎo)致睡眠時(shí)相提前綜合征、季節(jié)性情感鐘愛、腫瘤等疾病的發(fā)生[4]。Period1和Period2是重要的生物節(jié)律基因，在調(diào)節(jié)生物鐘節(jié)律中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠Period基因敲除后，其腫瘤發(fā)生及細(xì)胞增殖和異型性變化顯著增加[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，Period1和Period2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)。但是，有關(guān)節(jié)律基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用鮮有報(bào)道。本研究觀察了Period1和Period2在胃癌組織中的表達(dá)變化，探討二者在胃癌發(fā)生及進(jìn)展中的意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2012年2月～2015年8月在?？谑兄嗅t(yī)院擇期行手術(shù)切除治療的胃癌患者138例，其中男81例、女57例，年齡(59.8±9.5)歲。所有患者術(shù)前未接受放化療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診；腫瘤位于胃體部59例，胃底和賁門部69例；腫瘤最大徑≥5 cm 54例，<5 cm 84例；組織分化程度：低分化75例，中分化34例，高分化29例；浸潤(rùn)深度：黏膜及黏膜下層21例，肌層25例，漿膜層92例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期85例；Lauren分型：彌漫型61例，腸型77例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移83例。術(shù)中均留取患者胃癌組織及癌旁>5 cm的正常胃組織，-70 ℃液氮中保存以備檢。

1.2主要試劑與設(shè)備兔抗人Period1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcom公司，兔抗人Period2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abnova公司；TRIzol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購(gòu)自大連博瑞得生物公司，Period1、Period2及其內(nèi)參引物均由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成，MaxVision2/HRP試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3胃癌及癌旁組織中Period1和Period2檢測(cè)采用免疫組化法。取胃癌及癌旁組織，于4%甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、脫蠟；用3% H2O2浸泡15 min，PBS沖洗3次；用胰蛋白酶消化10 min，用PBS沖洗3次；將兔抗人Period1、Period2多克隆抗體(PBS代替一抗作為陰性對(duì)照)加入，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次；將多聚酶標(biāo)二抗加入，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次；用DAB顯色5 min，水洗、復(fù)染、脫水、透明、封片、觀察。結(jié)果判定：于100倍光學(xué)顯微鏡下選取結(jié)構(gòu)良好、背景清晰的5個(gè)視野，高倍鏡下每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞率<25%為1級(jí)，25%～﹤50%為2級(jí)，50%～﹤75%為3級(jí)，≥75%為4級(jí)；1級(jí)為陰性，2～4級(jí)為陽(yáng)性。

1.4胃癌及癌旁組織中Period1和Period2基因檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取胃癌及癌旁組織，研磨后用細(xì)胞裂解液裂解；用TRIzol總RNA提取試劑盒提取組織的總RNA，并檢測(cè)純度，取A260/A280≥1.80標(biāo)本完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板利用PCR試劑盒完成PCR。Period1、Period2和內(nèi)參引物：Period1上游引物5′-CCCACCCCACCAGCCACTAC-3′，下游引物5′-CCTGTGCCGGAGCGCGAGTC-3′； Period2上游引物5′-ATCTCTGACCAGGTTGCATC-3′，下游引物5′-CCAGAGTGCACTCTCTCTGC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CCAAAATCAGATGGGGCAATGCTGG-3′，下游引物5′-TGATGGCATGGACTGTGGTCATCA-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；92 ℃ 60 s，92 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后終止反應(yīng)。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔，用2-ΔΔCt法獲得胃癌及癌旁組織中Period1和Period2基因相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1胃癌及癌旁組織中Period1和Period2表達(dá)比較胃癌組織中Period1和Period2陽(yáng)性表達(dá)率分別為23.2%(32/138)、31.2%(43/138)，均低于癌旁組織中的44.9%(62/138)、64.5%(89/138)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

2.2胃癌及癌旁組織中Period1和Period2基因表達(dá)比較胃癌組織中Period1 mRNA和Period2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.05±0.10、1.09±0.12,均低于癌旁組織中的1.31±0.13、1.47±0.16，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

2.3Period1和Period2基因表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系胃癌組織中Period1 mRNA表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別及腫瘤最大徑、腫瘤位置和TNM分期均無關(guān)(P均>0.05)，而與分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Lauren分型有關(guān)(P均<0.05)；Period2 mRNA表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別及腫瘤最大徑、腫瘤位置均無關(guān)(P均>0.05)，而與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Lauren分型有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

表1　Period1和Period2基因表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4胃癌組織中Period1和Period2表達(dá)的關(guān)系胃癌組織中Period1與Period2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.285，P<0.05)，Period1 mRNA與Period2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.379，P<0.05)。

3　討論

胃癌作為消化系統(tǒng)較為常見的惡性腫瘤，由于目前尚無有效的早期檢測(cè)手段，且腫瘤惡性程度高、侵襲及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，多數(shù)患者預(yù)后不佳。因此，胃癌的相關(guān)發(fā)生機(jī)制一直是臨床研究熱點(diǎn)。近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[7]，機(jī)體正常生理活動(dòng)具有節(jié)律性，這種節(jié)律模式受機(jī)體節(jié)律基因的調(diào)控。節(jié)律基因在調(diào)控細(xì)胞增殖周期和凋亡、器官功能中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，亦可影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲過程[8]。Period1和Period2是維持正常機(jī)體節(jié)律所必需的節(jié)律基因，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)二者也是潛在的抑癌基因。Period1表達(dá)上調(diào)可通過激活癌細(xì)胞DNA損傷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[9]，與乳腺癌[10]、前列腺癌[11]等惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)；Period2過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞分化減少并加速凋亡發(fā)生，亦可通過重置細(xì)胞周期阻滯細(xì)胞在G2/M期而影響細(xì)胞周期進(jìn)程[12]。本研究免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌組織中Period1和Period2陽(yáng)性表達(dá)率均低于癌旁組織；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌組織中Period1 mRNA和Period2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于癌旁組織。說明Period1和Period2在胃癌組織中呈低表達(dá)，可能在胃癌發(fā)生中發(fā)揮抑癌基因的功能。

本研究結(jié)果顯示，Period1 mRNA表達(dá)量與胃癌組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Lauren分型有關(guān)，即分化程度越高、浸潤(rùn)深度越淺、不發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Lauren分型彌漫型，Period1表達(dá)水平越高。說明Period1基因可能與胃癌發(fā)生及細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移性有關(guān)，Period1表達(dá)受抑制可減少細(xì)胞凋亡發(fā)生、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性[13]。本研究顯示，Period2 mRNA表達(dá)量與分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Lauren分型有關(guān)(P均<0.05)，說明Period2亦與胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移性有關(guān)；Period2低表達(dá)可加速胃癌進(jìn)展，可能與其低表達(dá)加速細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)[14]。相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中Period1表達(dá)與Period2表達(dá)呈正相關(guān)，說明節(jié)律基因Period1與Period2可能發(fā)生協(xié)同作用而促進(jìn)胃癌發(fā)生及進(jìn)展過程。

綜上所述，Period1和Period2在胃癌組織中呈低表達(dá)，可能與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移、侵襲性有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步從細(xì)胞、分子水平予以深入研究明確。

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